中国不同地区猪和鸡肠道乳酸杆菌的耐药基因及耐药表型分析

作     者：张梦 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周忠新

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：乳酸杆菌 抗生素耐药基因 耐药表型 鸡肠道 猪肠道 

摘      要：抗生素耐药基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)在人或动物用药之前就天然存在于自然环境中,在水体、土壤、空气等环境介质中都检测到了多样性的ARGs,它近年已经被国内外定义为一种新型环境污染物。畜禽肠道微生物也是ARGs的一个重要储存库,不仅肠道病原性细菌含有高丰度、高多样性的ARGs,肠道益生共生菌也含有多样性的ARGs,它们随粪便排出体外后成为自然环境中ARGs积蓄污染的重要源头,威胁生态安全以及人和动物健康。肠道乳酸杆菌是畜禽肠道中一类主要的共生益生菌,也是筛选饲用乳酸杆菌的重要来源菌。目前较多研究已经报道了畜禽肠道病原性细菌中ARGs的流行情况,鲜见对全国范围内的畜禽肠道共生乳酸杆菌的ARGs污染丰度、多样性和耐药表型监测的研究。为了监测中国不同地区养殖场中猪和鸡肠道共生乳酸杆菌ARGs的总体污染特征和本底数据,本研究从华东(山东省、江苏省)、华南(广西)、西南(四川省)、华北(天津市、河北省)和华中(湖北省)地区的5个蛋鸡养殖场和5个生猪养殖场中分别采集了蛋鸡盲肠内容物和猪新鲜粪样,从中分离乳酸杆菌;然后利用实时荧光定量PCR技术测定乳酸杆菌中7类常用抗生素对应的21种ARGs的丰度和分布特征;并采用微量肉汤稀释法测定乳酸杆菌对7种常用抗生素的耐药表型。主要研究结果如下:(1)猪和鸡肠道乳酸杆菌中β-内酰胺类耐药基因bla Z、四环素耐药基因tet W、药物和杀菌剂耐药基因acr R、acr D和oqx B的相对丰度都较高,它们在猪肠道乳酸杆菌中的相对丰度范围分别为0.60-1.94(copies/16S r RNA)、0.14-0.51(copies/16S r RNA)、1.98×10-2.33×10(copies/16S r RNA)、1.81×10-4.83×10(copies/16S r RNA)和2.05×10-2.31×10(copies/16S r RNA),在鸡肠道乳酸杆菌中的相对丰度范围分别为0.42-0.82(copies/16S r RNA)、3.90×10-0.03(copies/16S r RNA)、6.16×10-8.05×10(copies/16S r RNA)、5.03×10-1.19×10(copies/16S r RNA)和9.22×10-6.02×10(copies/16S r RNA)。猪和鸡肠道乳酸杆菌中氨基糖苷类耐药基因arm A、rmt B、大环内酯-林可酰胺-链阳菌素(MLS)类耐药基因mef A、ere A和氟喹诺酮类耐药基因mex A都较低,它们的相对丰度范围都在10-10(copies/16S r RNA)。(2)不同地区养殖场分离的猪肠道乳酸杆菌中21种ARGs总相对丰度高于鸡肠道乳酸杆菌,其中猪肠道乳酸杆菌21种ARGs总相对丰度范围为0.24-3.50(copies/16S r RNA),鸡肠道乳酸杆菌21种ARGs总相对丰度范围为0.11-1.29(copies/16S r RNA)。(3)除湖北省地区,其他4个地区养殖场分离的猪肠道乳酸杆菌中β-内酰胺类耐药基因bla Z的相对丰度显著高于鸡肠道乳酸杆菌(P0.05);华东、华南、西南和华中地区养殖场分离的猪肠道乳酸杆菌中四环素耐药基因tet W的相对丰度显著高于鸡肠道乳酸杆菌(P0.05);除四川省地区,其他4个地区养殖场分离的猪肠道乳酸杆菌中MLS类抗性基因mph A的相对丰度显著高于鸡肠道乳酸杆菌(P0.05);全国5个不同地区分离的猪肠道乳酸杆菌中药物和杀菌剂耐药基因acr R的相对丰度显著高于鸡肠道乳酸杆菌(P0.05)。(4)本研究从100株乳酸杆菌中,筛选出了含较低丰度的bla Z、tet W、acr R、acr D和oqx B耐药基因的菌株,其中猪肠道乳酸杆菌3株,蛋鸡肠道乳酸杆菌8株,用于后续深入试验以开发饲用乳酸杆菌候选菌株。(5)猪和鸡肠道乳酸杆菌对卡那霉素、四环素和氯霉素有较高的耐药性,其中卡那霉素的MIC90为512μg/m L,四环素的MIC50为128μg/m L,氯霉素的MIC50为16μg/m L,环丙沙星的MIC90为128μg/m L;同时还发现了猪鸡肠道乳酸杆菌对氨苄西林和阿莫西林的耐药性表型,氨苄西林的MIC90为32μg/m L,阿莫西林的MIC90为64μg/m L。综上所述,猪和鸡肠道乳酸杆菌中β-内酰胺类、四环素类和药物杀菌剂类耐药基因的相对丰度都较高,且猪肠道乳酸杆菌中7类抗生素对应的21种代表性ARGs的总相对丰度高于鸡肠道乳酸杆菌,其中bla Z、tet W、mph A和acr R在猪肠道乳酸杆菌中比鸡肠道乳酸杆菌更为流行。猪和鸡肠道乳酸杆菌对卡那霉素、四环素和氯霉素耐药性较高,对氨苄西林和阿莫西林则耐药性较