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广东地区雏鹅肠道病毒组学分析及两株星状病毒的分离鉴定

广东地区雏鹅肠道病毒组学分析及两株星状病毒的分离鉴定

作     者:施建鑫 

作者单位:华南农业大学 

学位级别:硕士

导师姓名:罗开健

授予年度:2020年

学科分类:090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题: 病毒宏基因组学 星状病毒 分离鉴定 实时荧光定量PCR 

摘      要:中国是世界第一养鹅大国,广东又作为养鹅大省,然而,我国近些年不断出现鹅源的新发传染病,给我国养鹅业造成了巨大的经济损失。自2002年Breitbart首次对环境中病毒群落进行研究以来,病毒宏基因组学技术不断发展,大大拓展了人们对未知病毒的了解。因此,利用病毒宏基因组学对我国鹅携带的病毒群落进行调查,了解鹅携带的病毒种类,掌握病毒的变异和进化情况,有利于鹅类疾病的预警。本研究于2018年至2019年间,在广东省共采集了146只雏鹅的肠道样品。基于病毒宏基因组学对雏鹅肠道病毒群落的组成进行分析,比较了临床健康雏鹅与肠炎雏鹅肠道病毒群落的差异;针对鹅源星状病毒进行了系统研究:通过病毒的分离与动物回归试验了解其致病性;通过病毒全基因组的扩增,了解病毒基因组特征与遗传进化特点;并且建立了特异性检测方法。主要研究结果如下:(1)分别对10份肠炎雏鹅肠道样品与10份临床健康雏鹅肠道样品进行病毒宏基因组学测序与分析,共获得55237条重叠序列(contigs),其中2682条注释到病毒序列。注释到的病毒序列进一步分为39个病毒科。其中,脊椎动物病毒注释到23个病毒科,细菌噬菌体注释到6个病毒科,植物病毒注释到6个病毒科,昆虫病毒注释到3个病毒科,原生生物病毒注释到1个病毒科。通过比较临床健康雏鹅与肠炎雏鹅肠道的病毒群落,认为星状病毒、细小病毒及腺病毒可能是引起雏鹅肠炎的病原。(2)在肠炎雏鹅样品中检测到两个基因型的鹅星状病毒,并通过接种鹅胚成功分离到一株鹅星状病毒和一株新型鹅星状病毒,分别命名为GoAstV_QY/103和GoAstV_QY/126。对两种基因型的鹅星状病毒进行致病性实验,发现GoAstV_QY/103株感染雏鹅后仅发生轻微腹泻症状;GoAstV_QY/126株感染雏鹅表现痛风症状,剖检后可见胆囊有尿酸盐沉积。两型鹅星状病毒均无法对雏鹅致死,且都能通过粪便向外界环境持续排毒,对雏鹅组织有广泛的侵嗜性。(3)对两型鹅星状病毒的全基因组进行测定,表明GoAstV_QY/103株基因组全长为7230 nt;GoAstV_QY/126株基因组全长为7115 nt。结构与经典星状病毒一致,包含5’-UTR、3’-UTR和三个开放阅读框ORF1a、ORF1b、ORF2。同源性比较分析发现,两型鹅星状病毒的核苷酸同源性为58%,ORF2蛋白遗传距离为0.594,初步说明两型鹅星状病毒为两种不同的星状病毒。GoAstV_QY/126株与SD1株(MF772821)等能造成雏鹅致死性痛风的新型鹅星状病毒衣壳蛋白氨基酸序列比较,发现存在部分氨基酸发生替代。(4)建立新型鹅星状病毒SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究扩增出ORF2基因一段1325 bp大小的保守区域,并将该扩增片段克隆至pMD18-T载体上。将该质粒进行10倍梯度稀释,作为标准模板来进行实时荧光定量PCR扩增,建立实时荧光定量PCR标准曲线。标准模板浓度在6.88×10-6.88×10copies/μL范围内呈现良好的线性关系,其扩增相关系数为0.9994。建立的新型鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测浓度为6.88×10copies/μL;特异性强,对常见鹅源病毒(H9N2亚型禽流感病毒、坦布苏病毒、鹅细小病毒、鸭呼肠孤病毒)的检测均为阴性。重复性结果表示组内重复变异系数为0.25%-1.61%、组间变异系数为0.55%-2.21%,表明重复性好。综上所述,本研究应用病毒宏基因组学方法对我国广东省雏鹅肠道病毒群落组成进行了调查,不仅丰富了鹅类病毒数据库,还发现了大量其他宿主的病毒,为鹅类跨宿主病毒性传染病的预警工作提供了理论基础。并且在肠炎雏鹅样品中分离到两个基因型的鹅源星状病毒,通过致病性实验与基因遗传进化分析,为鹅源星状病毒流行病学与分子生物学研究提供了研究基础。建立的新型鹅星状病毒实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强、重复性好,可用于新型鹅星状病毒的临床检测。

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