BmVps13d基因影响家蚕茧丝量的机制研究

作     者：赵锣超 

作者单位：江苏科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李木旺

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：家蚕 BmVps13d CRISPR/Cas9 茧丝量 

摘      要：液泡蛋白转运相关蛋白（vacuolar protein sorting-associated protein,VPS）是一类在细胞内具有特异性识别、分拣和转运物质等功能的蛋白家族。细胞内脂质和蛋白质等物质的运输,主要包括进出细胞质膜的运输,这种运输方式受到细胞精确的调控,以维持细胞及其细胞器的完整性和动态性。VPS蛋白在细胞内物质的分拣和运输过程中扮演重要的角色,对细胞生长发育具有重要的作用。在多个物种中已报道过Vps13d蛋白具有调控发育的功能,但是在家蚕中该蛋白的功能分析还未见报道。本研究根据本课题组已报道的137个不同茧丝性状的家蚕品系全基因组测序结果,筛选出可能与家蚕茧丝量有关的家蚕囊泡蛋白分选相关蛋白基因（Bombyx mori vacuolar protein sorting associated protein 13d,BmVps13d）。本研究首次利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术初步探究了该基因在家蚕中的生物学功能。主要的研究结果如下:1、为了初步探究BmVps13d基因在家蚕中的功能,本研究对该基因进行生物信息学分析和编码区测序。BmVps13d蛋白功能域预测结果表明,Vps13d蛋白在家蚕、黑腹果蝇和智人中具有相同的功能域;同源性比对结果显示,BmVps13d蛋白与黑腹果蝇、智人的Vps13d蛋白分别有28.70%和28.18%的相似性,表明这三个蛋白可能具有相似的功能;JS（高丝量）、兰10（低丝量）家蚕品系中BmVps13d基因的编码区序列比对表明,在这两种家蚕品系中两者不存在差异,说明该基因的编码区对JS和兰10家蚕茧丝量没有影响。2、为了深入探究BmVps13d基因在家蚕中的功能,本研究分别采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）和启动子克隆测序检测JS、兰10家蚕中该基因相对表达水平和启动子序列差异,并通过双荧光素酶报告实验验证了其启动子活性差异。RT-q PCR结果表明,在JS和兰10品系五龄第三天家蚕丝腺和中肠中,该基因存在显著的差异表达。预测、克隆BmVps13d基因启动子区域,测序结果表明,相比于JS品系家蚕,在兰10品系家蚕中BmVps13d基因预测的启动子区域序列存在一个9 bp的碱基插入和2个腺嘌呤核苷酸的缺失。因此,推测该基因预测的启动子区域序列差异可能影响了其启动子的活性,从而导致BmVps13d基因在JS和兰10家蚕丝腺中差异表达。采用双荧光素酶报告实验,将JS和兰10家蚕中BmVps13d基因预测的启动子区域（2.0kb）分别克隆、转染到BmN细胞中,结果显示,在BmN细胞中,JS家蚕中BmVps13d基因预测的启动子活性显著高于兰10。3、本实验通过单片段同源重组的方法成功构建了转基因质粒p XL[IE1-Ds RedU6-BmVps13d-sg RNA]和△BmVps13d突变体家蚕品系。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对家蚕中BmVps13d基因进行靶向诱导突变,结果表明BmVps13d基因的突变主要发生在原型间隔区相邻基序（PAM）区域附近,该区域内出现了不同碱基数目的缺失。表型调查结果表明,BmVps13d基因突变后,五龄第三天△BmVps13d突变体家蚕幼虫体重下降了24.7%;全茧量下降了27.1%（雌性）和11.8%（雌性）;茧层率下降了2.4%（雌性）、2.9%（雌性）。RT-q PCR结果表明,BmVps13d基因的突变降低了△BmVps13d突变体家蚕中编码丝胶蛋白基因的表达,说明BmVps13d基因可能对家蚕幼虫丝蛋白合成和生长发育具有较大影响。本研究为探究影响家蚕茧丝产量的分子机制研究提供了线索,对高丝量家蚕品系的选育具有重要的参考价值。