重楼皂苷Ⅰ抑制IL-1β诱导的人髓核细胞凋亡相关机制研究

作     者：苗辉 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王兵

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：椎间盘退变 重楼皂苷Ⅰ 髓核细胞 lncRNAMALAT1 miR-503 

摘      要：[目 的]研究重楼皂苷Ⅰ对椎间盘退变中髓核细胞的抗凋亡作用以及对髓核细胞中lncRNAMALAT1 与 miR-503 的影响。[方 法]①人髓核细胞分离培养及鉴定:将手术台上获取的人椎间盘组织,在无菌条件下进行分离,得到髓核组织,传代培养至第3代用于后续实验。以人纤维环细胞为对照,通过qPCR检测髓核细胞内角蛋白KRT19的表达量,完成对髓核细胞的鉴定。②CCK-8法检测重楼皂苷Ⅰ最佳浓度:将第3代生长良好的人髓核细胞,分别与5、10、20、40、60、80、100 μg/mL的重楼皂苷Ⅰ混合,并设置空白组（只加培养基）、对照组（髓核细胞加培养基）,采用CCK-8法计算细胞存活率,来测定重楼皂苷Ⅰ作用于髓核细胞的最佳作用浓度。③CCK-8法检测重楼皂苷Ⅰ最佳作用时间:分成以下8组:髓核细胞培养24h、36h、48h;髓核细胞+40 μg/mL重楼皂苷Ⅰ培养24h、36h、48h,并设置空白组（只加培养基）、对照组（髓核细胞加培养基）,采用CCK-8法计算细胞存活率,来测定重楼皂苷Ⅰ最佳作用时间。④重楼皂苷Ⅰ药效及qPCR检测:共分成4组:对照组（髓核细胞加培养基）、髓核细胞+40ug/ml重楼皂苷Ⅰ组、髓核细胞+100ng/ml IL-1 β组、髓核细胞+100ng/ml IL-1 β+40ug/ml重楼皂苷Ⅰ,各组作用24h后,倒置显微镜下观察各组髓核细胞形态,流式细胞凋亡术检测各组髓核细胞凋亡情况,CCK-8法检测各组髓核细胞存活率,qPCR检测重楼皂苷Ⅰ对髓核细胞中lncRNA MALAT1与miR-503表达量的影响。⑤双荧光素酶基因检测lncRNA MALAT1与miR-503是否有共同结合位点:将lncRNA MALAT1-WT、lncRNA MALAT1-MU 分别与 miR-503 mimic、miR-503 NC 结合并共转染人肾胚293T细胞,以转染空质粒作为对照,以海肾荧光素酶为内参质粒。[结 果]①与人纤维环细胞组相比,人髓核细胞组中KRT19 mRNA表达量明显升高（P0.05）。②重楼皂苷Ⅰ作用于髓核细胞的最佳作用浓度为40μg/mL（P0.05）,髓核细胞存活率最高为116.12±1.01%;③重楼皂苷Ⅰ作用于髓核细胞的最佳作用时间为24h（P0.05）,其髓核细胞存活率为116.64±1.45%;④空白对照组:髓核细胞呈多角形、梭形,形状不规则,多个细长突起从细胞四周发出,细胞胞体透亮,具有折光性,细胞轮廓清晰。髓核细胞经IL-1β诱导后,髓核细胞形态发生了明显改变,细胞形态不清晰,出现颗粒状凋亡小体,镜下可见明显细胞核碎裂及核固缩。将重楼皂苷Ⅰ作用于经IL-1β诱导的髓核细胞,可部分逆转细胞凋亡情况,镜下可见颗粒状凋亡小体密集度降低。⑤流式细胞凋亡术检测各组髓核细胞凋亡率由高到低依次是髓核细胞+100ng/ml IL-1β（55.86±0.47%）、髓核细胞+100ng/ml IL-1β+40ug/ml 重楼皂苷Ⅰ（29.05±0.59%）、正常髓核细胞（3.90±0.74%）、髓核细胞+40ug/ml重楼皂苷 Ⅰ（3.81±0.35%）。⑥CCK-8法检测各组髓核细胞存活率由高到低依次为髓核细胞+40ug/ml重楼皂苷 Ⅰ（112.70±1.01%）、髓核细胞（100.40±0.69%）、髓核细胞+100ng/ml IL-1β+40ug/ml 重楼皂苷 Ⅰ（71.83±0.51%）、髓核细胞+100ng/mlIL-1β（55.49±0.46%）。⑦qPCR检测各组髓核细胞miR-503表达水平由高到低依次是髓核细胞+100ng/mlIL-1β、正常髓核细胞、髓核细胞+100ng/ml IL-1β+40ug/ml重楼皂苷Ⅰ、髓核细胞+40ug/ml重楼皂苷Ⅰ;LncRNAMALAT1表达水平由高到低依次是髓核细胞+40ug/ml重楼皂苷Ⅰ、髓核细胞、髓核细胞+100ng/ml IL-1β+40ug/ml重楼皂苷 Ⅰ、髓核细胞+100ng/ml IL-1β。⑧双荧光素酶基因检测结果显示,lncRNAMALAT1-WT与miR-503 mimic共转染细胞组与其余各组相比,萤火虫荧光素酶强度下降了 60%（P0.05）,但其余各实验组与对照组之间均无显著差异（P0.05）。[结 论]1.重楼皂苷Ⅰ可抑制IL-1 β诱导的髓核细胞凋亡,并且是通过对miR-503、lncRNAMALAT1调控发挥的抗炎作用。2.双荧光素酶基因检测证明lncRNAMALAT1与miR-503具有直接靶向关系。