藏药兔耳草抗DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎活性与机制及质量标准研究

作     者：王新红 

作者单位：江西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾金祥

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 1005[医学-中医学] 100513[医学-民族医学(含：藏医学、蒙医学等)] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：全缘兔耳草 溃疡性结肠炎 网络药理学 质量标准 大车前苷 

摘      要：目的:应用UPLC-Q-TOF/MS技术鉴定藏药兔耳草基原植物全缘兔耳草化学成分,应用网络药理学方法结合药理药效实验探讨其抗溃疡性结肠炎机制,并对兔耳草药材的质量标准研究,以为藏药兔耳草的临床应用及质量控制提供依据。方法:(1)成分鉴定方法:采用Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(100 mm×2.1mm,1.8μm)色谱柱,流动相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈溶液(B),梯度洗脱(0～8min,5%-10%B;8～10min,10%-15%;10～25min,15%-25%;25～40min,25%-45%;40～45min,45%-95%),柱温35℃,流速0.3ml/min,进样量2μl。利用Peakview软件分析质谱信息,结合文献比对化合物质谱一级、二级碎片离子参数和保留时间等鉴定全缘兔耳草成分结构。(2)网络药理学研究方法:首先,通过TCMSP与Swiss Target Prediction数据库对所鉴定的全缘兔耳草成分进行靶点预测,统一在Uniprot蛋白质数据库将化合物靶点名称进行规范。接着,以“colitis、“Inflammatory Bowel Diseases为关键词,利用Gene Cards、OMIM、Drug Bank、TTD、Dis Ge NET数据库检索与结肠炎相关的疾病靶点。然后,将获得的活性成分靶点和疾病靶点通过Venny网站取交集,把交集靶点导入STRING数据库进行人类全基因组蛋白互作,得到的结果再导入Cytoscape3.7.2软件,使用Cyto NCA插件对共有靶点进行拓扑分析和筛选后得到核心靶点,筛选标准为DC、BC和CC分别大于1倍中位数,选取Degree值前5名靶点为关键靶点目标进行分子对接。使用DAVID数据库对核心靶点进行GO和KEGG富集分析,并利用Cytoscape软件构建成分-核心靶点-通路关系网络图。最后,通过RCSB PDB数据库下载前5个关键靶点相对应蛋白的三维结构,使用i GEMDOCK2.1软件进行分子对接,验证主要活性成分与疾病靶点的结合机制。(3)抗溃疡性结肠炎研究方法:以3%DSS自由饮用的方式造模7天,给药与造模同时进行。设置正常组,模型组(3%DSS组),阳性药物组(柳氮磺吡啶),全缘兔耳草低剂量组、中剂量组、高剂量组,其中全缘兔耳草低、中、高剂量组给药剂量分别为0.13g/kg、0.26g/kg、0.52 g/kg,阳性药组给药剂量0.20 g/kg。收集血清与结肠组织,检测血清与结肠组织中NO、MPO、TNF-α、IL-1β炎症因子表达,对结肠组织进行HE染色,同时采用Western blot技术研究网络药理学预测的前5个关键靶点蛋白表达水平。(4)质量标准研究方法:采用2020版《中国药典》方法,建立指纹图谱,筛选共有峰,确定指标成分,对19批兔耳草药材进行薄层鉴别、显微鉴别、含量测定、水分、灰分检查,方法学考察,根据研究结果,建立兔耳草药材质量标准。结果:(1)全缘兔耳草化学成分分析结果:共鉴定了32个成分,其中黄酮类8个、苯丙素苷类9个、环烯醚萜苷类13个、酚酸类1个、其他类1个。(2)网络药理学预测抗溃疡性机制研究结果:32个全缘兔耳草成分共获得预测靶点388个,成分靶点与疾病靶点取交集后得到共有靶点213个,对交集靶点进行蛋白互作网络(PPI)分析得到核心靶点76个,排名前五的核心靶点依次为AKT1、VEGFA、TNF、EGFR、CASP3,对核心靶点进行GO与KGEE富集分析,结果显示富集了399个GO生物学过程和106条KEGG代谢通路;分子对接表明大车前苷、松果菊苷等绝大多数成分与关键靶点均有较好的结合能力。(3)抗溃疡性结肠炎研究结果:全缘兔耳草中、高剂量组均能下调溃疡性结肠炎小鼠中血清与结肠组织中NO、MPO、TNF-α、IL-1β等炎症因子的表达,减轻结肠组织损伤;另外,Western blot研究结果表明,全缘兔耳草中、高剂量组均能下降AKT1、VEGFA、TNF-α、EGFR、CASP3这5个关键蛋白表达水平。(4)藏药兔耳草质量标准研究结果:综合质谱分析与指纹图谱研究及药理药效研究结果发现药典规定的大多数兔耳草药材不含松果菊苷或松果菊苷含量较低,但多数兔耳草药材均含大车前苷且含量较高,因此最终选择大车前苷作为质量控制指标性成分。总体质量标准控制指标分别为:大车前苷含量不低于1.44%,水分不得过7.18%,总灰分不得过7.33%,酸不溶性灰分不得过0.83%,醇溶性浸出物不得少于7.94%。结论:本文明确了全缘兔耳草主要化学成分信息,结合网络药理学与实验验证阐明了全缘兔耳草抗溃疡性结肠炎活性与作用机制,制订了兔耳草质量标准,为兔耳草的临床药用及质量提供了参考依据。