基于JNK通路探讨人源性重组蛋白p75ECD-Fc治疗缺血性脑卒中的作用

作     者：黄俊凌 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗海芸

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：脑缺血 p75ECD-Fc proBDNF p-JNK Caspase-3 

摘      要：[目 的]脑卒中是一类具有高致命、高致残率的疾病,至今仍无特效的治疗药物。大脑中动脉栓塞时,缺血半暗带p75神经营养因子受体（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）高表达,p75NTR通过结合神经营养因子促进神经元凋亡。课题组前期研究表明,脑缺血时p75ECD-Fc阻断p75NTR而发挥抗脑缺血作用,但具体机制目前仍未知。本实验拟研究p75NTR是否参与脑缺血后的损伤;以及人源性重组蛋白p75ECD-Fc治疗脑缺血的作用和可能的作用机制。[方 法]体内实验:培育p75NTR敲除的C57BL/6小鼠（p75NTR（-/-））。采用光化学法建立小鼠局灶性脑缺血模型。分组1:野生型假手术组、野生型模型组、p75NTR（-/-）假手术组、p75NTR（-/-）模型组,分组2:野生型假手术组、野生型模型组、野生型p75ECD-Fc组（10mg/kg）、野生型依达拉奉组（15 mg/kg）。每组15只小鼠。p75ECD-Fc溶液,仅给药1次。p75ECD-Fc组在缺血5h后尾静脉注射一次p75ECD-Fc;依达拉奉组在缺血5h后尾静脉注射依达拉奉,每天一次,连续7天;假手术组和模型组注射等量PBS稀释的人源性Fc片段。术后第3天每组5只小鼠取脑,TTC法检测脑缺血面积。余下小鼠术后第7天检测行为学,随后取脑,Western Blot、免疫组化法检测p-JNK、JNK、Caspase-3和Cleaved-Caspase-3等蛋白表达情况,TUNEL检测细胞凋亡,ELISA检测proBDNF表达量。体外实验:使用SH-SY5Y细胞。p75 siRNA沉默p75NTR基因。建立氧糖剥夺/再灌注模型（Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygen,OGD/R）。分组 1:Control 组、OGD/R 组、siRNA 组、OGD/R+siRNA 组。分组 2:Control组、OGD/R 组、OGD/R+p75ECD-Fc 组、OGD/R+p75ECD-Fc+SP600125组。p75ECD-Fc200pg/mL,SP600125 10μM。CCK-8 法检测细胞活力,Western Blot、免疫荧光法检测蛋白表达情况,TUNEL检测细胞凋亡。[结果]1 体内实验:1.1行为学检测结果:①转轮试验:与野生型模型组小鼠相比,p75NTR（-/-）模型组在转轮上运动的最大速度和时间均增加,差异有统计学意义（p0.05）。与野生型模型组相比,野生型p75ECD-Fc组、野生型依达拉奉组在转轮上运动的最大速度和时间均增加,差异有统计学意义（p0.05）。②胶带移除试验:与野生型模型组小鼠相比,p75NTR（-/-）模型组接触胶带与移除胶带时间均缩短,差异有统计学意义（p0.05）。与野生型模型组相比,野生型p75ECD-Fc组、野生型依达拉奉组接触胶带与移除胶带时间均缩短,差异有统计学意义（p0.05）。③圆筒试验（）:与野生型模型组小鼠相比,p75NTR（-/-）模型组双侧前肢接触圆筒壁的次数增加,差异有统计学意义（p0.05）。与野生型模型组相比,野生型p75ECD-Fc组、野生型依达拉奉组双侧前肢接触圆筒壁的次数增加,差异有统计学意义（p0.05）。1.2 TTC检测结果:与野生型模型组小鼠相比,p75NTR（-/-）模型组白色缺血梗死面积减少,差异有统计学意义（p0.05）。与野生型模型组相比,野生型p75ECD-Fc组、野生型依达拉奉组白色缺血梗死面积减少,差异有统计学意义（p0.05）。1.3 pro-BDNF（ELISA）检测结果:与野生型模型组小鼠相比,p75NTR（-/-）模型组pro-BDNF表达量减少,差异有统计学意义（p0.05）。与野生型模型组相比,野生型p75ECD-Fc组、野生型依达拉奉组pro-BDNF表达量减少,差异有统计学意义（p0.05）。1.4 Western Blot检测结果:与野生型模型组小鼠相比,p75NTR（-/-）模型组p-JNK、Caspase-3蛋白表达量减少,差异有统计学意义（p0.05）。与野生型模型组相比,野生型p75ECD-Fc组、野生型依达拉奉组p-JNK、Caspase-3蛋白表达量减少,差异有统计学意义（p0.05）。1.5 IHC检测结果:与野生型模型组小鼠相比,p75NTR（-/-）模型组Caspase-3阳性表达的光密度值减少,差异有统计学意义（p0.05）。与野生型模型组相比,野生型p75ECD-Fc组、野生型依达拉奉组Caspase-3阳性表达的光密度值减少,差异有统计学意义（p0.05）。1.6 TUNEL检测结果:与野生型模型组小鼠相比,p75NTR（-/-）模型组TUNEL凋亡阳性表达的光密