SERPINA5抑制滋养细胞侵袭参与子痫前期发生的临床及机制研究

作     者：曾山水 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨红玲

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：子痫前期 蛋白质组学 SERPINA5 滋养细胞 细胞侵袭 

摘      要：目的子痫前期(Preeclampsia,PE)是一种在表现形式和病理生理学上具有异质性的综合征,其发病机制尚不完全清楚,这阻碍了临床预测、治疗或预防的发展。对高患病风险的妊娠进行早期干预有助于预防PE发生。因此,有必要采用新的策略对新的早期筛查标志物及其作用机制进行深入调查。在此,我们构建了一项前瞻性病例对照研究,试图筛选出新的PE早期预测标志物,并通过细胞及动物模型探索其潜在分子机制。方法1.子痫前期潜在标志物的筛选(1)采用双中心、三阶段巢式病例对照研究筛选PE早期标志物。研究共纳入366对PE孕妇和正常妊娠孕妇(1:1配对),及60名非妊娠期妇女。在PE发生前采集血清及其临床资料。(2)标志物筛选阶段共含48对PE及正常妊娠的孕早期血清样本,采用非标记高效液-质相串联质谱进行定量。使用R软件及Cluster Profiler软件包对差异蛋白进行功能注释及标志物筛选。(3)标志物妊娠分布阶段包括45对早孕,94对中孕,65对晚孕和55对产后收集的PE和正常妊娠血清以及60名非孕妇血清,通过ELISA检测。通过横断面分析评估候选标志物在正常妊娠及PE妊娠中的表达模式,及其水平对PE患病的影响。(4)模型验证阶段纳入59对PE及正常妊娠的孕早期血清样本,通过ELISA检测。采用受试者工作曲线(ROC)分析候选标志物对PE的预测价值。2.潜在标志物SERPINA5与子痫前期的相关性分析(1)收集人早孕期胎盘及蜕膜组织,通过免疫组织化学和免疫荧光染色确定SERPINA5在胎盘及蜕膜组织的表达部位。(2)过度炎症反应在胎盘绒毛外滋养细胞(EVT)侵袭不良中发挥重要作用。使用脂多糖(LPS)在体外诱导EVT细胞的炎症反应,并评估其对SERPINA5表达及细胞侵袭的影响。(3)构建过表达SERPINA5的孕大鼠模型,检测血压、蛋白尿等PE表型变化;通过苏木素-伊红和Masson染色分析大鼠胎盘、肾脏组织的PE病理学改变;分析PE模型鼠血清及胎盘组织SERPINA5表达与PE发生的相关性。3.潜在标志物SERPINA5参与子痫前期发生的机制(1)确定circ RNA/mi RNA/SERPINA5的调控关系。通过RNA反义纯化及mi RNA测序筛选靶向SERPINA5 m RNA的mi RNA,并通过双荧光素酶报告实验验证结合关系;分析PE孕妇外周血单个核细胞的circ RNA微阵列芯片数据集,筛选与候选mi RNA结合的circ RNA;通过PCR实验明确EVT细胞及PE胎盘中相应circ RNA、mi RNA及SERPINA5的表达相关性。(2)通过免疫共沉淀实验筛选与SERPINA5相互作用的下游因子。然后,构建过表达及敲除SERPINA5表达的HTR-8/SVneo细胞,通过蛋白酶谱、q RTPCR、Western Blot实验分析SERPINA5对下游因子及细胞侵袭影响。结果***5是子痫前期潜在分子标志(1)与对照组相比,PE组有76种血清蛋白水平增高,38种水平降低。其中,SERPINA5(FC=5.12)可能是与PE新致病因子。SERPINA5与PE的关系尚未见报道。生信分析显示,SERPINA5功能涉及调节丝氨酸蛋白酶活性、凝血级联和急性炎症反应,可能参与了PE的病理生理进展。(2)SERPINA5在PE妊娠的分布模式与正常妊娠相似,但水平明显高于正常妊娠。孕13-20周血清SERPINA53.23μg/ml的孕妇随后患早发型PE(OR=6.33,95%CI 1.67-24.03)和晚发型PE的风险(OR=4.33,95%CI 1.53-12.27)均明显增加。(3)妊娠20周前,结合SERPINA5和炎症因子(CRP、IL-6和SERPINC1)的模型显著提高了PE的预测能力,AUC上升到0.85(95%CI 0.78-0.90),灵敏度为0.81,特异度为0.69。2.潜在标志物SERPINA5与子痫前期的发生相关(1)在孕早期胎盘和蜕膜中,SERPINA5主要在EVT和蜕膜腺体上皮中表达,说明其可能参与调节早期胎盘中EVT的侵袭。(2)SERPINA5处理可抑制EVT细胞侵袭(P=0.003),而LPS处理促进原代EVT细胞SERPINA5表达(RQ mean=1.45,P=0.01),同时侵袭能力减弱(P=0.001)。说明SERPINA5可能是通过抑制EVT细胞侵袭致胎盘生成不良而引发PE的,炎症反应有参与其中。(3)过表达SERPINA5的大鼠呈现PE表型(高血压和蛋白尿);同时,过表达组呈现相应的不良妊娠结局(胎盘重量降低,低出生体重,胚胎丢失率升高(P均0.05))。过表达组胎盘和肾脏出现PE相关病理组织改变,胎盘迷宫/交界区比例明显增加,肾脏出现纤维性肾小球病样变化。***5