LINC01094上调VMA21表达促进胃癌进展作用的研究
作者单位：中国医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：戴冬秋
授予年度：2022年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
主 题：胃癌 LINC01094 VMA21 增殖 迁移 侵袭
摘 要：背景和目的:胃癌作为比较常见的恶性肿瘤之一,目前发病率排在全球癌症发病率中第五位,死亡率在全球癌症有关的死亡率排名中占在第四位。针对胃癌的治疗方法仍以手术切除为主,手术前后的辅助性放化疗及术中进行有效的淋巴结清扫等有助于改善胃癌患者的预后,但由于缺乏胃癌早期诊断的特异性生物标志物,且胃癌早期的症状不是很明显,患者确诊时往往处于胃癌的晚期,大部分患者会发生局部复发或伴有远处转移,导致预后较差。因此,需进一步研究胃癌的发生、发展和转移的新的分子机制,探索新的诊治方法和有效的治疗靶点对改善胃癌患者的预后有极其重要的意义。人类基因组计划研究发现,人类全部基因组序列中很少部分的基因具有编码蛋白质的功能,没有编码蛋白质功能的基因组序列占98%左右,它们通常转录后形成长短不一的非编码转录本。其中的长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lnc RNAs）是指由RNA聚合酶II转录形成的长度大于200nt,不具备编码蛋白质功能的长链RNA分子。多项研究表明长链非编码RNA可以参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性进展的过程。虽然有研究报道,长链基因间非编码RNA LINC01094在胶质瘤、卵巢癌和乳腺癌等一些实体瘤中表达上调,并促进上述肿瘤的进展,但是在胃癌中的表达情况以及对胃癌进展的作用尚不清楚。本研究旨在明确LINC01094在胃癌细胞系及组织中表达情况,并且通过生物信息学分析及预测,进行一系列分子生物学实验,进一步揭示LINC01094在胃癌中所起的作用及潜在的机制。我们检测了LINC01094在胃癌中的表达水平并分析了其与临床病理学特征的关系。我们进一步证实了LINC01094在胃癌增殖、侵袭和迁移等恶性进展中的作用,并通过生物信息学分析和分子生物学实验确定与其LINC01094表达相关的基因VMA21。最后,我们证实了LINC01094通过调控VMA21的表达来促进胃癌的进展。研究方法:本研究中,我们下载了TCGA（The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图谱）数据库中375例胃癌组织以及32例癌旁正常胃组织中的RNA-Seq高通量数据和相对应的临床信息,并使用R语言等生物信息学分析软件分析LINC01094在胃癌组织中的表达水平及与临床病理学特征之间的关系。用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测LINC01094在胃癌细胞系和42对胃癌及相对应癌旁正常胃组织中的表达情况,并分析其与临床病理学特征的关系。我们选取LINC01094高表达的胃癌细胞系HGC-27转染LINC01094的小干扰RNA（si RNA）和LINC01094低表达的细胞系MKN-74转染LINC01094过表达载体,分别在这两种细胞系中敲除和过表达LINC01094并同时设置相对应的对照组。通过CCK-8、克隆形成、Transwell实验和划痕愈合实验分别检测实验组和对照组细胞的增殖、侵袭和迁移能力。使用生物信息学软件分析和预测LINC01094表达相关的基因VMA21,进行q RT-PCR和Western blot实验检测其在胃癌中的表达水平,并进行挽救实验证实LINC01094调控VMA21的表达,进而在胃癌发生、发展中发挥的作用。结果:1.LINC01094在胃癌组织及细胞系中高表达。分析LINC01094在375例胃癌及32例癌旁正常胃组织中的RNA-Seq高通量数据,提示LINC01094在胃癌中表达上调（P0.001）并与TNM分期相关（P0.05）。42例胃癌患者肿瘤组织及其对应的癌旁正常胃组织的q RT-PCR结果提示,LINC01094在肿瘤组织中高表达,且LINC01094的高表达与肿瘤的浸润深度（P=0.03）、肿瘤的淋巴结转移（P=0.013）及TNM分期（P=0.028）正相关。同时,LINC01094在胃癌细胞系中表达上调,其中HGC-27细胞系的表达水平最高,MKN-74细胞系的表达水平最低。2.LINC01094通过上调VMA21的表达促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在HGC-27和MKN-74细胞系中分别转染LINC01094的si RNAs和LINC01094过表达载体并进行相关的细胞功能实验。CCK8和克隆形成实验结果提示沉默LINC01094可有效地抑制胃癌细胞的增殖,而过表达LINC01094可促进胃癌细胞的增殖。划痕愈合实验结果表明下调LINC01094可抑制胃癌细胞的迁移,而上调LINC01094可促进胃癌细胞的迁移。Transwell实验结果也证实敲低LINC01094可减弱胃癌细胞的侵袭能力,而过表达LINC01094可增强胃癌细胞的侵袭能力。生物信息学分析发现LINC01094与VMA21之间存在明显的正相关关系（R=0.22,P0.001）,通过q RT-PCR和Western blot实验发现VMA21在胃癌中的表达上调。沉默或过表达LINC01094后,VMA21的表达水平有显著的降低或升高。此外,通过挽救实验发现在敲低LINC01094的胃癌细胞中同时转染VMA21的过表达载体,胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有明显的恢复,说明过表达VMA21部分地逆转了沉默LINC01094对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。结论:1.LINC01094在胃癌组织及细胞系中高表达,并且LINC01094的高表达与胃癌的TNM分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关。2.LINC01094通过上调VMA21的表达促进胃癌的增殖、迁移和侵袭等恶性进展。
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