基于网络药理学策略研究norartocarpetin抗急性胃炎的作用机制

作     者：李文艳 

作者单位：江西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱继孝

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：网络药理学 NTP 急性胃炎 作用机制 

摘      要：急性胃炎(Acute gastritis,AG)是由各种致病因素(乙醇、感染、进食刺激性食物、严重创伤、大出血、手术、休克、精神极度紧张等)引起的急性胃粘膜炎症。据统计数据显示,由急性糜烂出血性胃炎所导致的胃出血约占所有上消化道出血病例的10%～30%,随着经济社会的高速发展,AG的发病率呈明显增长趋势,严重影响了人们的生活质量。而AG的西药治疗具有一定的副作用和局限性。现代药理研究证明,中药具有抗炎作用,且毒副作用较小。因此,从天然产物中找到更安全有效的抗AG药物成为了消化科药物研究的趋势。课题组前期从桑科波罗蜜属植物白桂木根中分离到黄酮类化学单体norartocarpetin(NTP),前人研究表明NTP具有抗炎的活性。鉴于此,本课题首先基于网络药理学方法对NTP进行治疗AG的潜力进行评价并预测了相关的关键靶点,然后通过经口急性毒性试验确定了NTP的安全范围,最后采用动物药理模型对其抗AG的功效进行了验证,并进行了相关作用机制的探讨。目的:评价NTP抗阿司匹林-盐酸诱导的小鼠急性胃炎的功效,并探究其相关作用机制,为NTP的进一步开发利用奠定实验依据。方法:(1)采用网络药理学方法评价NTP抗急性胃炎的潜力并筛选作用靶点。(1)将NTP输入Pubchem网站,搜索其化学结构。(2)通过Pharm Mapper网站和Swiss ADME网站搜索NTP的化合物靶点,将搜索结果进行合并,删除重复的化合物靶点。(3)通过Dis Genet网站、Drugbank网站、Gene Cards网站、OMIM网站搜索急性胃炎的疾病靶点,将搜索结果进行合并,删除重复的AG疾病靶点。(4)运用Venny网站找出化合物靶点和疾病靶点的交集靶点,将交集靶点输入String网站进行蛋白互作,用Cyto scape软件从交集靶点中筛选出关键靶点。(2)NTP的急性毒性评价:(1)取SD小鼠30只,随机分为空白组、溶媒组、用药组,每组12只,雌雄各6只。(2)采用急性毒性分级法,以初始给药剂量2000 mg/kg,对用药组小鼠单次经口给药NTP(溶解于5%CMC-Na),灌胃体积为40 m L/kg。(3)给药后,连续观察十四天,异氟烷麻醉后经眼眶取血,离心,制备血清,放入4℃冰箱储存备用。脱颈椎处死小鼠,取心、肝、脾、肺、肾,予以称重并计算脏器指数;肝、肾组织用4%多聚甲醛溶液浸泡48小时后做HE染色。(4)检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、血尿素氮(BUN)的水平,以评价NTP的急性肝、肾毒性。(3)NTP抗急性胃炎的药效验证及作用机制研究:(1)取SD雄性小鼠60只,随机分为空白组、模型组、阳性药组、NTP低剂量组、NTP中剂量组、NTP高剂量组,每组10只;除空白组外,其它小鼠均采用2%阿司匹林-1.84%盐酸(v/v,1:1)混合试剂诱导法制备小鼠急性胃损伤模型。(2)造模1 h后,低、中、高剂量组小鼠分别灌胃给药不同剂量的NTP(25、50、100 mg/kg);阳性药组小鼠灌胃三九胃泰(5196 mg/kg);空白组、模型组小鼠灌胃同等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液;给药4次,每次间隔4 h。(3)末次给药5 h后,异氟烷麻醉,经眼眶取血,离心,制备血清,放入4℃冰箱储存备用。;脱颈椎处死小鼠,取出小鼠胃组织,用4%多聚甲醛溶液固定。(4)Elisa法测试小鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)、微板法检测胃组织一氧化氮(NO)水平;胃组织病理切片做HE染色;蛋白印迹法测定胃组织中环氧合酶-2(cyclooxyganese-2,COX-2)、核转录因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的蛋白表达情况。结果:(1)NTP治疗急性胃炎潜在关键靶点的筛选:(1)通过Pharm Mapper和Swiss ADME网站共搜索到255个NTP的化合物靶点。(2)通过Dis Genet、Drugbank、Gene Cards、OMIM等网站搜索到1337个急性胃炎疾病靶点;(3)将化合物靶点和疾病靶点放入Venny网站,共筛选出104个交集靶点,将交集靶点放入String网站进行蛋白互作,用Cyto scape软件从交集靶点中筛选获得了39个潜在关键靶点,其中包括前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2),PTGS2又称为环氧化酶-2(Cy-clooxygenase-2,COX-2)。(2)NTP的急性毒性评价:与对照组小鼠比较,NTP给药组小鼠在观察期间无死亡情况、无明显中毒现象,体重增长趋势及脏器指数无显著差异;血清ALT、AST、ALP、TP、BUN含量无显著变化(P0.05),雄性溶媒组、雄性用药组、雌性溶媒组有个别小鼠ALB水平降低,但差异无统计学意义(P0.05)。(3)NTP抗急性胃炎的药效验证及作用机制研究:NTP各剂量组均可显著降低小鼠IL-1β和NO水平(P0.01或P0.05),且具有剂量依赖性;胃组织病理切片显示:模型组小鼠胃黏膜上皮缺失、坏死,并伴有出血、水肿及炎性细胞浸润;给药组小鼠胃组织炎性浸润减轻,胃损伤得以改善。给药组小鼠胃组织显著下调了COX-2、NF-κB蛋白表达。结论:(1)网络药理学研究结果提示了NTP作为抗AG药物的潜力,同时预测了其作用的潜在靶点。(2)急性毒性实验表明,NTP单次给药剂量2000mg/kg,对小鼠肝、肾功能无明显损伤,属于低毒性药物。(3)采用阿司匹林-盐酸诱导的小鼠AG模型验证了NTP抗AG的功效,其作用机制与降低COX-2、NF-κB表达,降低炎症因子IL-1β、NO含量有关。本研究为进一步基于NTP的抗急性胃炎药物研究奠定了实验数据。