石榴花瓣花青苷生理指标及其生物合成相关基因表达分析

作     者：王沙 

作者单位：南京林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：苑兆和

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：石榴 花青苷 bZIP MYB 基因功能 

摘      要：石榴(Punica granatum L.)是历史上栽培较早的果树之一,也是国家规划的优势特色经济林树种之一。它是一种集生态、经济、社会与观赏价值于一身的优良果树和园林植物,得到了世界各国的广泛重视。花青苷作为一种以水溶性色素形式存在的次生代谢类物质,不仅为植物提供绚丽的色彩,还在植物生长发育过程中起关键作用。本研究为了鉴定调节石榴花瓣花青苷生物合成途径的基因,以‘榴花白’、‘榴花粉’和‘榴花红’三种观赏石榴盛花期花瓣为试材,测定不同花色的观赏石榴花瓣颜色指标,花青苷、蔗糖、类胡萝卜素和类黄酮含量,苯丙氨酸酶(PAL)、查尔酮异构酶(CHI)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)和二氢黄酮醇还原酶(DFR)活性。探究不同花色观赏石榴生理指标之间的差异性和相关性。利用生物信息学方法鉴定石榴MYB和bZIP基因家族成员,分析部分基因的表达特性。采用同源重组法克隆得到PgMYB11、PgMYB111、PgbZIP16和PgbZIP34的CDS全长,分析不同花色和不同组织中PgMYB11、PgMYB111、PgbZIP16和PgbZIP34基因的表达特性以及不同花色中石榴花青苷生物合成酶编码基因的表达特性。通过亚细胞定位、烟草瞬时表达和拟南芥转化验证PgMYB11、PgMYB111、PgbZIP16和PgbZIP34的基因功能。主要研究结果如下:(1)‘榴花红’的花瓣色彩饱和度、蔗糖含量、花青苷含量、类胡萝卜素含量、4C L酶活性、CHI酶活性和DFR酶活性显著高于‘榴花粉’和‘榴花白’,而类黄酮含量在‘榴花白’中最高。PAL酶活性和C4H酶活性在‘榴花粉’中最高。(2)蔗糖含量、CHI酶活性和DFR酶活性与花青苷均呈极显著正相关(P0.01),类黄酮与花青苷呈极显著负相关(P0.01)。且蔗糖与CHI酶活性、DFR酶活性呈极显著正相关(P0.01),因此,蔗糖含量的增加可能会促进石榴花瓣花青苷积累。(3)从‘泰山红’参考基因组中筛选鉴定出170个MYB基因,聚类为25个亚组(S1～S25),同一亚组中的MYB基因包含相似的保守基序,其中,S7和S6两个亚组能够调控花青苷生物合成途径中EBGs和LBGs阶段生物合成酶编码基因的表达,在花青苷生物合成中起作用。(4)从‘泰山红’参考基因组中筛选鉴定出65个bZIP基因,聚类为13个亚组(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、M和S),相同亚组中的石榴bZIP基因之间具有相似的基因结构,并存在串联复制现象。拟南芥研究表明,H组中At HY5和At HYH能够促进花青苷合成。(5)PgMYB11全长为1088 bp,编码395个氨基酸,PgMYB111全长为1101 bp,编码366个氨基酸,PgbZIP16全长为510 bp,编码170个氨基酸,PgbZIP34全长为522 bp,编码174个氨基酸。亚细胞定位表明PgMYB11、PgMYB111、PgbZIP16和PgbZIP34四个蛋白均为核定位。q RT-PCR结果表明,这几个基因在石榴果皮和花中表达量较高。(6)构建35S::GFP-PgMYB11、35S::GFP-PgMYB111、35S::GFP-PgbZIP16和35S::GF P-PgbZIP34过量表达载体转化烟草叶片发现,在烟草叶片中这四个基因的表达、花青苷含量和生物合成酶编码基因的表达趋势一致。(7)将构建的35S::GUS-PgMYB11和35S::GUS-PgbZIP16过量表达载体沾花法转化拟南芥后,结果表明T2代拟南芥植株中花青苷含量高于野生型拟南芥,并且促进了花青苷生物合成中主要生物合成酶编码基因的表达。不同浓度蔗糖处理下的PgbZIP16转基因阳性植株中花青苷含量随蔗糖浓度的上升而增加。