外泌体miRNA对鼻咽癌顺铂化疗耐药的基础研究

作     者：刘梦雅 

作者单位：右江民族医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：刘津

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：外泌体 鼻咽癌细胞 CNE-1 化疗耐药 miR-424 多药耐药 

摘      要：目的:探讨外泌体在鼻咽癌细胞顺铂耐药机制中的的作用研究。方法:以鼻咽癌细胞CNE-1为基础,利用浓度梯度递增与大剂量药物冲击相结合的方法建立鼻咽癌耐药细胞系,进行形态学观察,CCK-8法检测其耐药指数,免疫印迹法(Western blot)检测耐药蛋白的表达三种方法以验证耐药细胞系的建立及相关耐药机制。利用Transwell小室将耐药细胞与敏感细胞共培养,通过CCK8检测共培养后细胞的耐药性,Western blot检测耐药蛋白的变化;利用差速离心法提取细胞外泌体,通过透射电子显微镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析(NTA)法检测外泌体的分子大小、Western blot检测外泌体特征蛋白TSG101、CD9、CD81的表达三种方法相结合对提取的外泌体加以验证。利用PKH67对外泌体进行荧光标记染色,并与敏感细胞共培养,通过共聚焦显微镜观察外泌体被细胞摄取的过程。分别提取耐药细胞、敏感细胞来源的细胞培养上清液中的外泌体,检测其差异基因表达情况。利用行miR-424mimics对细胞CNE-1进行转染,检测转染后细胞FASN蛋白表达水平。结果:建立的鼻咽癌耐药细胞系CNE-1/DDP,耐药指数为5.15;显微镜下观察可见敏感细胞呈现规则的圆形,耐药细胞呈不规则的梭形或多边形状态,耐药蛋白MVP、P-gp蛋白高表达。共培养后的敏感细胞耐药指数为1.98,形态学变化尚不明显,耐药蛋白相比敏感细胞有提高。透射电镜观察外泌体形态为30-150nm类圆形双层膜结构,粒径分析显示外泌体密度为2.2×10^11个/ml,直径集中分布于50-150nm之间,其同时表达TSG101、CD9、CD81三种蛋白,证实我们提取外泌体是正确的。共聚焦显微镜下观察到PKH67绿色荧光蛋白标记的外泌体,可被CNE-1细胞摄取。鼻咽癌耐药细胞来源的外泌体相对敏感细胞miR-424表达升高。将鼻咽癌细胞CNE-1进行miR-424mimics的转染,转染后检测细胞FASN蛋白表达水平随之升高。结论:鼻咽癌耐药细胞通过分泌的外泌体可导致敏感细胞耐药,导致这一现象的原因可能与外泌体携带的miR-424有关。