朱砂叶螨TcCCE06介导的甲氰菊酯对映体代谢差异研究

作     者：何玉涵 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何林;张平

授予年度：2021年

学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：朱砂叶螨 甲氰菊酯 对映异构体 羧酸酯酶 代谢差异 

摘      要：朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）是农业上广泛分布的一种多食性害螨,目前对朱砂叶螨等农业害螨的防治手段主要是以化学杀螨剂为主。由于朱砂叶螨具有世代周期短、繁殖能力强、体型微小、孤雌生殖等特点,导致朱砂叶螨抗性问题十分突出。甲氰菊酯是目前防治朱砂叶螨的常用药剂,目前商品化的甲氰菊酯都是以外消旋体的形式存在,即R-甲氰菊酯:S-甲氰菊酯的比例为1:1,因此有关朱砂叶螨对甲氰菊酯代谢的研究都是基于外消旋体的,而有关朱砂叶螨对甲氰菊酯对映体代谢差异的研究还未见报道。本论文主要研究TcCCE06介导朱砂叶螨对甲氰菊酯对映体代谢差异,取得了如下研究结果:1.朱砂叶螨体内解毒酶系增效剂实验抑制实验结果表明:朱砂叶螨体内谷胱甘肽过氧化物酶、羧酸酯酶和细胞色素P450酶经抑制剂顺丁烯二酸二乙酯（DEM）、磷酸三苯酯（TPP）和胡椒基丁醚（PBO）抑制后,增效比分别为0.87、16.35和2.27倍,表明朱砂叶螨（敏感品系）体内参与甲氰菊酯解毒代谢的主要酶系为羧酸酯酶和细胞色素P450酶,且羧酸酯酶起主要作用。2.甲氰菊酯诱导朱砂叶螨后转录组测序及定量验证对筛选的可能参与甲氰菊酯代谢的13条CarEs基因和2条P450s基因进行实时荧光定量（RT-qPCR）分析,获得敏感品系和甲氰菊酯对映体诱导后这15条基因的m RNA表达谱。结果表明,S-甲氰菊酯和R-甲氰菊酯诱导后有8条基因表达量与敏感品系（SS）无显著差异;R-甲氰菊酯诱导后有7条基因表达量显著高于敏感品系,上调倍数在2.03～36.31倍之间;S-甲氰菊酯诱导后有6条基因表达量显著高于敏感品系,上调倍数在3.58～22.96倍之间;5条基因在S-甲氰菊酯和R-甲氰菊酯分别诱导后相对表达量存在显著差异。3.甲氰菊酯代谢相关酯酶基因克隆和原核表达根据转录组及RT-qPCR定量结果,将TcCCE06基因作为朱砂叶螨代谢甲氰菊酯对映体的关键基因进行研究,克隆获得朱砂叶螨的TcCCE06基因,该基因c DNA全长有1737个碱基,编码578个氨基酸,命名为TcCCE06。生物信息学分析表明,TcCCE06属于J’’家族,且该基因与二斑叶螨tetur01g10800为同源基因。4.TcCCE06基因异源表达以及对甲氰菊酯对映体代谢差异研究构建了pCold Ⅱ-TcCCE06表达载体,原核表达TcCCE06并获得具有活性的TcCCE06重组蛋白。体外代谢实验表明,TcCCE06蛋白可以代谢甲氰菊酯的两个对映体,且对R-甲氰菊酯（无效体）的代谢速率快于S-甲氰菊酯（高效体）。20μg重组蛋白4 h内,分别代谢32.1%的R-甲氰菊酯（无效体）和13.8%的S-甲氰菊酯（高效体）,表明TcCCE06重组蛋白对甲氰菊酯对映体的代谢存在显著差异。