深海真菌Aspergillus puniceus A2次级代谢产物及其抗炎活性研究

作     者：蔡松岩 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：洪碧红

授予年度：2022年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083204[工学-水产品加工及贮藏工程] 

主      题：深海真菌 Aspergillus puniceus A2 次级代谢产物 抗炎活性 

摘      要：深海真菌长期生存于高压、低温、寡营养、黑暗等极端环境下,与陆生真菌相比,进化出独特的代谢途径,能够产生结构新颖,活性广泛的次级代谢产物。其结构类型包括聚酮类、生物碱类、萜类等结构类型,在抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等方面具有显著的生物学活性。因此,本文从9株深海真菌中筛选出次级代谢产物化学成分丰富的一株深海真菌Aspergillus puniceus A2(*** A2)作为目标菌株进行次级代谢产物及生物活性研究。采用固体发酵方法对该菌放大规模发酵,综合应用多种色谱学分离纯化方法从发酵产物中分离得到18个单体化合物(1?18),利用NMR和质谱等现代波谱技术并结合文献资料报道鉴定所得单体化合物的化学结构,其中2个为新化合物(1,2);16个为已知化合物,化合物结构主要包括呫吨酮类(4,5,6,9,10,11,14,15),苯丙素类(7,12,13,16),氧杂喹唑啉酮生物碱类化合物(3),倍半萜类化合物(8)和环酮化合物(17,18)。通过炎症介质、炎症细胞因子和炎症通路相关基因等指标测试了化合物的抗炎活性,为探究活性化合物在医药、食品行业中的应用提供参考。研究的主要内容与结论如下:1.目标菌株的筛选选取9株深海来源菌株采用大米培养基、小米培养基、燕麦培养基3种固体培养基和PDB液体培养基进行小规模的发酵培养。萃取浓缩得到粗提物后,利用薄层层析、高效液相色谱等化学分析方法,筛选出次级代谢产物化学成分丰富度高的一株深海真菌*** A2作为目标菌株进行下一步活性成分分离纯化研究。2.深海真菌*** A2的次级代谢产物研究采用大米固体培养基进行大规模的发酵培养,综合应用正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析、高效液相色谱法等化学分离方法对发酵培养得到的代谢产物进行分离纯化,最后经核磁共振等波谱分析技术并结合文献数据分析对单体化合物进行结构鉴定,共鉴定出18个化合物,其中新化合物2个,分别命名为1-(2-甲氧基-3,5-二羟基)苯基-1,2-丙二醇(1)和1-(2-甲氧基-3,5-二羟基)苯基-1-羟基-丙酮(2);已知化合物16个,包括8个呫吨酮类化合物:Austocystin I(4),Austocystin G(5),6-methoxyl austocystin A(6),Austocystin F(9),F02ZA-1593B(10),Austocystin A(11),Austoc ystin H(14),Austocystin B(15);4个苯丙素类化合物:3-[(1’E,3’E)-1’,3’-hept adienyl]-6,8-dihydroxy-1’,3’dienylisocoumarin(7),5-[(3E,5E)-3,5-nonadienyl]-1,3-benzenediol(12),2,4-dihydroxy-6-((3E,5E)-nona-3,5-dien-1-yl)-benzoic acid(13),Embeurekol C(16);1个氧杂喹唑啉酮生物碱类化合物:Oxepinamide F(3);1个倍半萜类化合物:Malfilanol B(8);2个环酮化合物:5,6-dihydroxy-2,3,6-tri methylcyclohex-2-enone(17),(R)-Mevalonolactone(18)。3.深海真菌*** A2次级代谢产物的抗炎活性研究对鉴定出的化合物进行抗炎活性评价。采用CCK-8法检测细胞活力,Griess法检测细胞释放一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的含量,ELISA法检测细胞中的炎症细胞因子,RT-PCR法检测炎症通路相关基因的表达。实验结果显示化合物1,2,13和14在20?M浓度时,对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞不显示细胞毒性,并且可以显著抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导细胞RAW264.7释放炎症介质NO,抑制炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的释放,降低NF-κB通路相关基因包括诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)和环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的表达,并且增加核因子E-2-相关因子2(Nuclear erythroid 2-related factor 2,Nrf2)的表达;加入Nrf2特异性抑制剂ML385后,细胞因子及m RNA的表达水平被逆转,表明化合物1,2,13和14