Tfam敲除的CD11c+树突状细胞对多发性硬化发生发展的影响及其作用机制

作     者：方雪纯 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：管红兵

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：多发性硬化 线粒体转录因子A 树突状细胞 实验性自身免疫性脑脊髓炎 

摘      要：背景多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是炎症性脱髓鞘疾病,发生在中枢神经系统(Central nervous system,CNS),是青壮年比较常见的非创伤性神经系统性疾病。氧化应激、线粒体功能障碍是MS疾病进展、组织损伤和脱髓鞘最为主要的原因。树突状细胞(Dendritic cells,DC)为最主要的抗原提呈细胞。其捕获抗原,提呈给T细胞,然后启动T细胞的免疫应答。DC调节CD4T细胞分化,并对CNS自身免疫反应及外周免疫发挥耐受与监控的作用,DC向CNS的迁移和激活是MS发病机制中的一个关键因素。Tfam是一个编码线粒体转录因子A(TFAM,mitochondrial transcription factor A)的核基因,它既稳定线粒体DNA(Mitochondria DNA,mt DNA)又启动了mt DNA复制,调控氧化应激反应和线粒体正常功能。TFAM可激活DC细胞的亚群,放大Toll样受体9(Toll Like Receptor 9,TLR9)信号,并触发促炎的细胞因子的释放。mt DNA被证明是由TLR9感应并促进全身的炎症及器官损伤,TFAM增强了Cp G DNA诱导的浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,p DC)的活化,导致肿瘤坏死因子的释放增加,从而促进T细胞抗原特异性的免疫应答。据研究表明,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有抗氧化特性,能够靶向线粒体功能障碍,MSCs移植的细胞治疗改善了MS发生发展,增加了线粒体生物发生,转录物过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(peroxisome proliferator‐activated receptor gamma‐coactivator 1,PGC-1a)和TFAM的表达水平上调。研究发现,TFAM对调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)的功能至关重要。表达Foxp3的Treg细胞能够抑制常规T细胞反应,建立自身耐受性,以防止自身免疫,并维持组织的稳态。Foxp3缺乏会导致Treg细胞的发育和功能不正常,导致自身免疫性疾病的发生,TfamFoxp3小鼠出现了严重的炎症性疾病,如小鼠体型变小、皮肤出现炎症、脱发等,早期致死率较高,因此,Tfam敲除的Treg细胞导致免疫稳态的改变与自身免疫的发展。目前对于TFAM的表达如何影响DC的功能研究甚少,TFAM在MS中的作用还不明确,本课题应用Tfam敲除的CD11cDC来观察实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的发生和发展,从而阐明这些问题,我们建立了TfamCD11c小鼠,构建EAE模型,在此模型中Tfam特异性地在DC(Tfam)中敲除,借此我们研究Tfam对CD4T细胞分化及EAE发生发展的影响。目的本研究通过构建TfamCD11c小鼠,通过m RNA测序GO、KEGG富集分析,找到CD11cDC中Tfam基因特异性敲除富集到的信号通路,为探讨Tfam调节CD11cDC的免疫功能提供了相关的分子机制基础。研究EAE模型中Tfam对CD4T细胞分化及EAE发生发展的影响,在转录水平层面通过m RNA测序GO、KEGG富集分析,找到EAE模型Tfam对CD4T细胞分化富集的信号通路及相关差异表达基因。材料与方法首先,利用条件性基因敲除技术,设计和构建打靶载体和基于Cre-lox P重组酶系统来建立表达CD11c特异性敲除Tfam基因的小鼠模型即TfamCD11c小鼠。我们取TfamCD11c小鼠和Tfam小鼠脾脏组织研磨成单细胞悬液并用流式细胞仪检测两组小鼠CD11cDC细胞比例并进行分型,分为p DC(CD11cCD317)、常规树突状细胞(conventional DC,c DC)(CD11cMHCⅡ),并检测DC成熟度标志物CD80、CD86。用Trizol法抽提CD11cDC的RNA,通过m RNA转录组测序检测CD11cDC基因表达谱。用生物信息学方法比较两组细胞间的显著差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),通过GO、KEGG富集分析差异表达蛋白质编码基因功能。我们通过对TfamCD11c小鼠和Tfam小鼠皮下注射含MOG肽段的CFA,在当天及48小时后对小鼠腹腔注射PTX溶液以建立EAE疾病模型。在用MOG肽段免疫小鼠后的第18天,此时的小鼠处于发病高峰期。在高峰期时,用流式细胞仪检测两组小鼠CD11cDC细胞比例并进行分型,分为p DC、c DC,并检测DC成熟度标记物CD80、CD86。同时检测小鼠脾脏组织CD4T细胞亚群T1、T1