漆酶/TEMPO体系氧化壳寡糖提高其清除ROS的研究

作     者：杨晓莉 

作者单位：天津科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：裴继诚

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

主      题：漆酶/TEMPO体系 壳寡糖 6-羧基壳寡糖 ROS清除 作用机制 

摘      要：衰老是任何生物随着年龄的增长发生的不可逆转的退化现象。衰老的加速与活性氧(ROS)有关,ROS是一类含氧原子的活性物质,游离状态的ROS会攻击细胞膜、脂肪酸、胶原蛋白等结构,加速皮肤的衰老。壳寡糖(COS)是一种碱性低聚糖,本身具溶解性、吸附性、成膜性等特点,在食品、医药、生物等领域有广泛的应用。本文选用低分子量、高脱乙酰度的COS,用一种绿色化学方法将COS氧化,制备出6-羧基壳寡糖(C-COS)并对其清除ROS的能力及作用机理进行研究,目的是寻求一种天然、高效、安全的抗衰老产品。首先,选择漆酶/TEMPO体系对COS进行选择性氧化,制备出C-COS,然后通过傅里叶红外光谱(FT-IR)、核磁共振碳谱(C NMR)、酸碱电导滴定对COS进行结构表征及氧化率计算。结果表明:在FT-IR谱图中,发现1600 cm与1410 cm处出现了新的C=O不对称伸缩振动吸收峰;在C NMR谱图中,发现氧化样品在化学位移181.61处出现了新的共振峰,与羧基(-COO)的共振峰相吻合,两者共同证明了漆酶/TEMPO体系氧化壳寡糖产生新的羧基官能团,成功制备出6-羧基壳寡糖。其次,检测COS与C-COS清除ROS能力及探究不同的样品浓度、时间、温度和羧基含量清除ROS的影响。结果显示:在0～5 mg/m L浓度范围内,随浓度的上升,样品对ROS的清除能力也逐渐增加,重要的是,C-COS较COS清除ROS能力显著提高6%～62%;在10 h范围内,C-COS与COS清除ROS效果呈先增强后减弱的趋势;当温度大于70°C时,样品溶液清除ROS效果减弱;不同羧基含量的C-COS清除ROS不同,在羧基含量为0～2.86%范围内,随C-COS中羧基含量增加清除ROS的能力增强。可见,浓度、时间、温度、羧基含量因素均对清除ROS效果有影响。然后,通过螯合亚铁离子实验结合紫外分光光度法对C-COS提高清除ROS作用机理进行分析。结果表明:在5 mg/m L时,C-COS螯合Fe能力比COS高32%,推测C-COS清除ROS能力的提高存在两种可能机制。第一种是通过螯合亚铁离子间接减少ROS数量实现的,C-COS的C6位-COO与Fe等金属离子螯合,进而阻止Fe等金属离子催化生成ROS;第二种是C-COS的-COO能抑制氨基质子化,促使其C2位氨基上的孤电子对提供更多电子给自由基(R·),生成稳定的自由基大分子,两种共存机制起协同作用,共同减少ROS的生成,达到清除ROS能力提高的目的。最后,根据我国医药行业最新标准(YY/T 0993-2015)对制备的C-COS进行安全性能检测。通过细胞毒理性检测,结果显示:细胞的成活率都在94%以上,表明C-COS符合新材料的安全应用标准。C-COS具有高效清除ROS的活性及良好的安全性,在化妆品行业及医药方面将有较好的应用和发展。