黑米花色苷调控内质网应激增强RPE细胞屏障功能机制研究

作     者：彭珍珍 

作者单位：中南林业科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：綦文涛;黄铮昱

授予年度：2022年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：黑米花色苷 矢车菊素-3-葡萄糖苷 视网膜色素上皮细胞 屏障功能 内质网应激 

摘      要：黑米富含花色苷类成分,对氧化应激引起的癌症、心血管疾病、糖尿病等慢性疾病具有预防作用,充分挖掘黑米花色苷的功能潜力和作用机制可为预防多种疾病提供理论依据。过量光暴露会造成视网膜光氧化损伤,引发不容忽视的公共健康问题。研究表明,摄入花色苷有助于维持视力健康,保护机制涉及缓解氧化应激、炎症和凋亡通路。但目前关于花色苷是否通过调控内质网应激发挥保护视力的报道还不多见,对其调控机制的探讨也不足。本研究以黑米为原料,按现行标准提取并测定多酚和花色苷含量,用XAD-7大孔树脂和Sephadex LH-20联合分离纯化;以N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺(N-retinylidene-N-retinyl-ethanolamine,A2E)和蓝光照射视网膜色素上皮(Retinal pigmented epithelium,RPE)细胞模拟人眼在长时间或过强的电脑或手机蓝光暴露下的氧化损伤过程,探讨黑米花色苷及其主要成分矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucoside,C3G)对RPE细胞屏障功能的保护作用及其保护机制是否涉及内质网应激关键通路。主要研究内容及结果如下:1.黑米花色苷的提取纯化及含量测定。选取黑珍珠、洋县3号、黑籼粘、黑香糯,以酸化甲醇超声法提取黑米多酚和花色苷,按行业标准(T/AHFIA 005-2018和NY/T 3164-2017)测定样品多酚和花色苷含量。结果表明:黑米总多酚和花色苷含量分别在0.8-1.8 mg GAE/g和0.08-0.87 mg C3G/g。紫外可见光谱扫描,黑米醇提物符合花色苷类典型光谱特性,高效液相色谱分析醇提物中C3G占花色苷总量的80%。黑籼粘的多酚和花色苷含量最高,以黑籼粘为原料进一步纯化花色苷,经XAD-7树脂纯化所得黑米粗提物中C3G含量为109.14 mg C3G/g,Sephadex LH-20葡聚糖凝胶再次纯化所得黑米花色苷提取物中 C3G 含量为 342.89 mg C3G/g。2.黑米花色苷对RPE细胞屏障功能的保护作用。建立A2E+蓝光诱导的RPE细胞损伤模型,结果表明:以25 μM A2E处理RPE细胞3 d,蓝光15000 lux照射细胞40 min,细胞存活率约为60%,基于该细胞模型研究黑米花色苷对RPE细胞及其屏障功能的保护作用及机制。CCK8结果表明:黑米多酚和花色苷呈剂量依赖性提高细胞存活率,150 μg/mL(10.61 μg/mL C3G)黑米多酚对光损伤RPE细胞具有显著(P0.05),即黑米花色苷对RPE细胞存活率的提高作用可能是其主要花色苷C3G发挥的作用。DCFH-DA荧光探针法测定细胞ROS水平,结果表明:黑米花色苷可呈剂量依赖性下调ROS水平,15μg/mL黑米花色苷可极显著(P0.05),以上结果表明C3G是黑米花色苷增强RP