CD147阳性小细胞外囊泡在肝细胞癌诊断及血管生成中的作用

作     者：黄德发 

作者单位：赣南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：钟田雨

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肝细胞癌 小细胞外囊泡 CD147 生物标志物 血管生成 

摘      要：目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,占所有肝癌类型70%～90%,居于癌症相关死亡原因第三位。HCC起病隐匿,大部分患者确诊时已经处于晚期,预后很差。HCC早期筛查主要通过腹部彩超和血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)检查。然而,不少HCC患者影像学检查不明确、AFP检测结果呈阴性,这将导致诊断难度增加,甚至延误早期治疗。小细胞外囊泡(small extracellular vesicles,s EVs)是细胞分泌的纳米级双层膜结构小囊泡,可将生物活性分子传递给受体细胞,影响其生物学特性,改变肿瘤微环境并产生长距离效应,广泛分布于人体各种体液中。肿瘤来源的s EVs被认为具有用作治疗剂和疾病生物标志物的潜力,已被证明在癌症进展过程中发挥作用。CD147是一种跨膜糖蛋白,在多种人类恶性肿瘤中过度表达,并且与肿瘤大小、癌症分期、进展和预后相关。但肝细胞癌来源的CD147阳性(CD147)的s EVs在肝细胞癌发生发展中的功能和分子机制未知。本研究探讨了HCC患者血浆来源小细胞外囊泡CD147作为临床诊断标志物的可行性,并研究了CD147的小细胞外囊泡在肝细胞癌进展中对血管生成的作用机制。方法:1.使用超速离心法分离获取s EVs,通过纳米流式检测仪(Nano FCM)、透射电子显微镜和免疫印迹(Western Blot,WB)实验对分离s EVs进行鉴定。2.通过纳米流式检测仪分析HCC患者、肝硬化(liver cirrhosis,LC)患者和健康人群(healthy donors,HD)血浆CD147阳性s EVs表达水平。3.通过计算受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评价CD147作为HCC诊断标志物的诊断效能。4.通过纳米流式检测仪分析HCC细胞系Hep G2细胞与正常肝细胞系LO2细胞来源CD147s EVs表达水平。5.使用Hep G2来源s EVs与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)共孵育,通过激光共聚焦显微镜观察s EVs是否被HUVEC细胞摄取。6.通过合成靶向干扰CD147的慢病毒,构建CD147稳定敲低的Hep G2细胞株。7.使用Hep G2细胞和CD147稳定敲低的Hep G2细胞来源s EVs处理HUVEC细胞。通过CCK-8增殖实验、划痕(wound healing)实验、小室侵袭(Transwell)实验和体外血管形成(Angiogenesis)实验分别检测HUVEC细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成能力。结果:1.Nano FCM检测到s EVs粒径均分布在50～180 nm;透射电子显微镜下观察到s EVs呈囊泡状,胞膜完整;WB检测到s EVs中三个阳性标志蛋白CD9、CD63和TSG101条带,而未检测到阴性标志蛋白GM130条带。2.与健康体检者相比,HCC患者血浆CD147s EVs表达量明显增高,差异有统计学意义(p0.001);LC患者血浆CD147s EVs表达量无明显变化,差异无统计学意义(p=0.862)。3.CD147s EVs与AFP联合检测对HCC具有较好的诊断效能,敏感性为88.39%,特异性为100%,其曲线下面积(area under curve,AUC)达到0.959。4.与LO2细胞来源s EVs相比,Hep G2细胞来源CD147s EVs表达量明显增高,差异有统计学意义(p0.01)。5.CCK-8增殖实验、划痕实验、小室侵袭实验和体外血管形成实验显示,Hep G2来源CD147s EVs可以显著促进HUVEC细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成能力(p0.05);而CD147稳定敲低的Hep G2来源s EVs处理HUVEC细胞后增殖、迁移、侵袭和血管生成能力降低(p0.05)。结论:1.超速离心法能够从外周血血浆中成功提取形态完整的s EVs。2.HCC患者血浆CD147s EVs明显高于健康人群,并且随着HCC分期进展显著增加。3.血浆中CD147s EVs高表达有成为HCC诊断生物标志物的潜力。4.HCC来源s EVs可能通过CD147促进HUVEC细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成能力,具有促进血管生成的功能。