新型冠状病毒开放读码框7a（ORF7a）对单核细胞和中性粒细胞浸润的影响

作     者：管俊 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱海红

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：新型冠状病毒肺炎 开放读码框 单核细胞 中性粒细胞 趋化 

摘      要：研究背景及目的:自2019年底,新型冠状病毒肺炎（Coronavirus disease 2019,COVID-19）肆虐全球,造成大面积流行和人员死亡。其病原体严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）通过细胞表面的血管紧张素转化酶2（ACE2）受体感染II型肺泡上皮细胞后,诱导细胞分泌特定细胞因子影响单核细胞和中性粒细胞浸润,改变肺泡局部免疫微环境,触发强烈的炎症反应,严重者可导致急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）,危及患者生命。SARS-CoV-2与SARS-CoV等冠状病毒相比显著不同,本研究通过Simplot软件分析不同冠状病毒基因组序列之间的相似性,发现SARSCoV-2基因组中具有显著差异的区域主要有开放读码框（Open reading frame,ORF）1ab、ORF2（Spike蛋白,S蛋白）、ORF6、ORF7和ORF8,其中ORF6、ORF7和ORF8区域序列差异尤其显著。ORF6、ORF7和ORF8对单核细胞和中性粒细胞趋化的影响尚无报道。因此,本研究拟进一步探究新冠病毒高变异区表达框ORF6、ORF7a和ORF8对II型肺泡上皮细胞A549细胞分泌细胞因子以及对单核细胞和中性粒细胞浸润的影响。研究方法:（1）利用Simplot软件进行基因组序列相似性分析,确定SARS-CoV-2基因组高变区包含的表达基因;（2）构建SARS-CoV-2高变异区表达框ORF6、ORF7a和ORF8慢病毒表达载体,使用上述慢病毒感染A549细胞,利用嘌呤霉素筛选出能成功表达目的蛋白的稳转株细胞;（3）通过q PCR和ELISA法测定稳转株细胞炎性细胞因子和趋化因子表达水平;（4）从健康人外周血中分离单核细胞和中性粒细胞,利用Transwell小室进行细胞迁移实验,探讨ORF7a对单核细胞或中性粒细胞细胞趋化的影响。研究结果:（1）SARS-CoV-2与SARS-CoV等其他冠状病毒的基因组序列相比,基因组序列差异显著区域的读码框为ORF1ab、S蛋白、ORF6、ORF7和ORF8,其中ORF6、ORF7和ORF8区域序列差异尤其显著;（2）成功构建表达SARS-CoV-2-ORF6、-ORF7a和-ORF8慢病毒表达载体以及感染上述慢病毒的A549细胞稳转株;（3）与对照组相比,A549-ORF6细胞表达TNF-α和IL-8增加,IFN-α减少,IL-6、IL-1β、IFN-β和CCL2无明显差异;A549-ORF7a细胞表达IL-6、IFN-α和CCL2增加,TNF-α和IL-8减少,IL-1β和IFN-β无明显差异;A549-ORF8细胞表达IL-1β、IFN-α、IFN-β和CCL2增加,IL-8减少,TNF-α和IL-6无明显差异。IL-1α、IL-10和CCL7均低于可检测限;（4）与对照组相比,A549-ORF7a细胞分泌趋化因子CCL2增加,进一步促进单核细胞趋化,加入CCL2抑制剂后单核细胞趋化明显减少;（5）与对照组相比,A549-ORF7a细胞分泌趋化因子IL-8减少,并抑制中性粒细胞浸润。加入IL-8抑制剂后中性粒细胞趋化减少,对照组变化尤为显著。研究结论:SARS-CoV-2 ORF7a可以通过诱导A549细胞分泌CCL2促进单核细胞浸润,同时减少A549细胞分泌IL-8抑制中性粒细胞趋化。