四君子汤通过调控谷氨酰胺代谢改善吉非替尼耐药的机制研究

作     者：王致红 

作者单位：北京协和医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李国辉

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：肺癌 四君子汤 吉非替尼 耐药 谷氨酰胺代谢 

摘      要：目的:1.通过体内外实验明确四君子汤能够改善吉非替尼耐药。2.阐明四君子汤通过调控谷氨酰胺代谢改善吉非替尼耐药的机制,以期为中西医结合治疗肺癌提供新的科学依据。方法:四君子汤改善吉非替尼耐药的体外研究:采用吉非替尼耐药细胞(PC9/GR细胞)和吉非替尼敏感细胞(PC9细胞)作为体外实验研究模型,以IC50值为指标,使用CTG法计算各组药物对细胞的抑制率,并采用金正均Q值对四君子汤和吉非替尼联合给药的协同效应进行评估。四君子汤改善吉非替尼耐药的体内研究:此部分共分为以下两部分:1.四君子汤联合吉非替尼对荷瘤小鼠的疗效研究:将Balb/C-nu雄性裸鼠按照体重随机分为4组:模型组、四君子汤组、吉非替尼组、四君子汤联合吉非替尼组,将1×106个PC9/GR细胞接种于Balb/C-nu裸鼠右后肢皮下,待裸鼠肿瘤体积长至约50～100 mm3(接种后第6天)时,开始灌胃给药,共灌胃21天。每日对小鼠活动状态进行观察并记录,评估各组荷瘤小鼠的基本情况;每隔3天测量小鼠体重,评估给药期间小鼠体重变化;给药21天后,将小鼠按照伦理要求处死,将肿瘤组织剥出并称重,测量肿瘤组织长和宽,评估各给药组对荷瘤小鼠的抑瘤效果;称量心肝脾肺肾质量计算脏器指数,观察各给药组对荷瘤小鼠脏器的影响;采用TUNEL染色法考察各组荷瘤小鼠的肿瘤细胞凋亡情况;采用HE染色法考察四君子汤联合吉非替尼对各组小鼠心肝脾肺肾组织病理学变化的影响;应用免疫组化法考察各组肿瘤组织中凋亡蛋白BAX和BCL-2表达水平变化的影响。2.四君子汤联合吉非替尼对谷氨酰胺代谢的影响:使用Western Blot技术和免疫组化法检测肿瘤组织中SLC1A5、GLS和GS表达情况;采用靶向代谢组学技术,以谷氨酰胺代谢相关代谢标志物,如谷氨酰胺、琥珀酸、顺乌头酸、谷氨酸、延胡索酸、甘氨酸、丙氨酸、丙酮酸和α-酮戊二酸等为研究对象,建立其含量测定方法,并通过该方法测定各组荷瘤小鼠血浆和肿瘤组织中各代谢标志物含量变化。结果:四君子汤改善吉非替尼耐药的体外研究:四君子汤能够提高PC9和PC9/GR细胞对吉非替尼的敏感性;单独或联合给药对这两种细胞有抑制作用,呈浓度依赖性,且无毒剂量的四君子汤联合不同浓度的吉非替尼具有协同抑制作用。因此,四君子汤在细胞水平可以改善吉非替尼耐药。四君子汤改善吉非替尼耐药的体内研究:1.四君子汤联合吉非替尼对荷瘤小鼠的疗效研究:与模型组和吉非替尼组比较,四君子汤组和联合给药组小鼠的日常状态较好;小鼠体重记录情况表明,模型组小鼠的体重随着时间延长明显上升,四君子组和联合给药组小鼠的体重无明显变化,吉非替尼组小鼠的体重略有下降;与模型组比较,四君子汤组和吉非替尼组肿瘤质量和肿瘤体积降低,无显著性差异,抑瘤率分别为32.2%、32.36%;与单独给药组比较,联合给药组肿瘤质量和肿瘤体积明显降低,有极显著性差异(p0.01),抑瘤率为67.91%,表明四君子汤和吉非替尼均能抑制肿瘤生长,且联合给药组抑制肿瘤生长疗效最佳;TUNEL染色结果显示四君子汤与吉非替尼联合给药可以促进肿瘤组织细胞凋亡;HE染色结果表明,各组小鼠心肝脾肺肾病理学结果未见明显异常;免疫组化结果显示,与单独给药组比较,联合给药组BCL-2表达下调,BAX表达上调,提示二者联合给药可以促进肿瘤细胞凋亡。2.四君子汤联合吉非替尼对谷氨酰胺代谢的影响:Western Blot和免疫组化结果显示,与模型组比较,单独给药组GLS、GS、SLC1A5表达下调;与单独给药组比较,联合给药组GLS、GS、SLC1A5表达下调。靶向代谢组学结果显示,测定的9种血浆谷氨酰胺代谢标志物中有显著差异的分别是谷氨酰胺、丙氨酸、琥珀酸、谷氨酸、丙酮酸,而顺乌头酸、α-酮戊二酸、甘氨酸、延胡索酸则无明显变化;与模型组比较,四君子汤组、吉非替尼组中谷氨酰胺含量上升,丙氨酸、琥珀酸、谷氨酸、丙酮酸含量下降;与四君子汤组、吉非替尼组比较,联合给药组谷氨酰胺、丙氨酸含量上升,琥珀酸含量下降;联合给药组谷氨酸、丙酮酸含量与四君子汤组比较下降,与吉非替尼组比较上升,但并无显著性差异。肿瘤组织中测出的7种谷氨酰胺代谢标志物中,发生显著变化的是谷氨酰胺和丙酮酸,其余无明显变化;与模型组比较,四君子汤组谷氨酰胺含量显著上升,丙酮酸含量显著下降,吉非替尼组谷氨酰胺、丙酮酸含量显著上升;与四君子汤组比较,联合给药组谷氨酰胺、丙酮酸含量上升;与吉非替尼组比较,联合给药组谷氨酰胺含量上升,丙酮酸含量显著下降。结论:1.四君子汤能够改善吉非替尼耐药。2.谷氨酰胺代谢可能是四君子汤改善吉非替尼耐药的重要机制之一,四君子汤可能是通过调控谷氨酰胺代谢上的重要靶点(SLC1A5、GLS和GS)影响谷氨酰胺代谢相关代谢标志物含量的变化,改善吉非替尼耐药。