基于MAPKs信号通路探讨Forskolin联合HSV-1在GBM中的抗肿瘤效应及机制

作     者：蒋佩文 

作者单位：成都医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李敏惠

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：单纯疱疹病毒1型 神经胶质母细胞瘤 Forskolin 联合疗法 

摘      要：研究背景与目的:神经胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是成年人中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中最常见、最致命的恶性肿瘤。目前GBM治疗的标准方案是以手术切除为主,再辅以放疗和替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)化疗的多模式组合疗法;然而治疗后患者1年以上的生存率低于30%,诊疗后五年的生存率约5%,仍然存在患者术后易复发、预后差、生存期短等问题,并且这些问题在过去几年里没有得到很好的解决。因此,迫切需要更有效的治疗策略来改善GBM的预后以延长患者的生存期。溶瘤病毒疗法(Oncolytic viruses therapy,OVT)作为治疗肿瘤的现代免疫疗法之一,近20年OVT逐渐成为GBM治疗的研究热点。大多数靶向GBM治疗的溶瘤病毒(Oncolytic viruses,OVs)研究主要涉及单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)和腺病毒等病毒株,而HSV-1是第一个在GBM小鼠模型实验中获得成功的OV,HSV-1应用于GBM的治疗有着广阔的前景。研究报道了HSV-TK/GCV通过降低MAPK/ERK活性以激活自噬诱导视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)毒性,而MAPKs信号通路是否参与调控了HSV-1对GBM的杀伤作用还未见研究报道。同时,由于单一的OVT存在靶向性不高、溶瘤效应不足、病毒复制限制等局限性,OVT的联合疗法渐渐成为OVs治疗肿瘤的发展趋势,越来越多的研究开始把OVs与其他疗法相结合(如小分子化合物、过继性T细胞疗法和免疫检查点抑制剂等),取得了较好的效果。小分子化合物佛司可林(Forskolin,FOR),是一种从植物毛喉鞘蕊花植物中分离得到的天然二萜类化合物,具有强大的激活腺苷酸环化酶(Adenylate Cyclase,AC)的作用,已有研究报道了Forskolin通过升高c AMP促进神经胶质瘤C6、神经胶质母细胞瘤U87细胞分化,抑制细胞增殖的作用。因此,本研究探讨HSV-1感染GBM细胞株LN229细胞后,肿瘤细胞的死亡方式及胞内信号通路的活化情况,在阐释HSV-1对LN229细胞杀伤效应的分子机制的基础上,进而探索Forskolin与HSV-1联合对LN229细胞的抗肿瘤效应及机制,以期为GBM的治疗提供新的选择方案以及OVT联合小分子化合物的治疗策略提供理论依据。材料与方法:研究首先选用HSV-1病毒F株、GBM细胞株LN229细胞,对病毒杀伤肿瘤细胞的效应(如细胞形态的改变、细胞死亡的方式等)以及此过程中MAPKs信号通路的活化情况进行探索;在阐释HSV-1的溶瘤效应及机制后,研究进一步探讨小分子化合物Forskolin与HSV-1联合对LN229细胞的协同抗肿瘤效应。方法第一部分:1.PCR扩增、产物测序鉴定病毒HSV-1(F株),采用TCID法对病毒滴度进行测定。2.采用显微镜成像法和CCK-8法检测HSV-1感染LN229细胞后细胞病变及细胞增殖抑制情况。3.使用PI、Annexin V-FITC/PI、DCFH-DA染色及Western Blot检测HSV-1感染LN229细胞后对细胞的生物学功能的影响,即细胞周期情况、凋亡比例、细胞内ROS水平和MAPKs信号通路(即MAPK/JNK、MAPK/p38和MAPK/ERK)的活化情况。第二部分:1.CCK-8法检测了Forskolin及Forskolin与HSV-1联合作用对LN229细胞增殖抑制的情况。2.采用RT-qPCR对HSV-1感染Vero细胞后的不同时间点病毒复制关键基因IE(ICP4)、E(UL12)和L(Us6)的表达情况进行检测,以建立更快捷、灵敏的病毒核酸定量检测方法;使用不同MOI的HSV-1感染Vero细胞24 h,RT-qPCR检测HSV-1基因IE(ICP4、ICP27)和E(UL12)的表达情况。3.采用显微镜成像法、Annexin V-FITC/PI、JC-1、DCFH-DA染色检测Forskolin联合HSV-1感染LN229细胞24 h后的协同抗肿瘤效应,即细胞的形态学改变、细胞死亡情况、细胞线粒体膜电位变化和细胞内ROS水平等。4.通过RT-qPCR检测Forskolin联合HSV-1感染LN229细胞后的病毒关键基因ICP4、UL12和Us6的表达情况。5.通过Western Blot检测Forskolin联合HSV-1作用LN229细胞后,肿瘤细胞内MAPKs信号通路的活化情况。结果:第一部分:1.PCR扩增、产物测序结果确定了供试HSV-1为F株,同时TCID法测定HSV-1(T4)的病毒滴度为1×10 TCID/m L。2.不同MOI的HSV-1感染LN229细胞24 h后,显微镜成像和CCK-8结果显示HSV-1可有效感染细胞、细胞形态发生典型的CPE并抑制LN229细胞增殖。3.不同MOI的HSV-1感染LN229细胞24 h后,PI、Annexin V-FITC/PI、DCFH-DA染色及Western Blot结果显示HSV-1可使细胞周期阻滞在G2/M期、诱导细胞凋亡、增加细胞内ROS水平并抑制MAPK/ERK、激活MAPK/JNK和MAPK/p38信号通路。第二部分:1.CCK-8结果显示天然小分子化合物Forskolin可抑制LN229细胞增殖,24h的IC为52.65μmol/L。2.不同时间点检测Vero细胞内HSV-1的IE(ICP4)、E(UL12)和L(Us6)期基因,RT-qPCR结果显示IE期基因在2 h时已开始表达,24 h各期基因均已表达,成功建立快捷、灵敏、重复性高的病毒核酸检测RT-qPCR法;不同MOI的HSV-1感染Vero细胞后,RT-qPCR检测结果显示MOI为1.25时,IE(ICP4和ICP27)基因表达水平显著增加,MOI分别为1.25和5时ICP27表达差异不显著;MOI为5时,IE(ICP4和ICP27)、E(UL12)期基因表达水平均显著增加。3.CCK-8法检测Forskolin与HSV-1联合对肿瘤细胞增殖的抑制效应,结果显示联合作用的IC为6.802μmol/L,较单一的Forskolin和/或HSV-1作用差异显著,可增强对LN229细胞增殖的抑制作用;同时倒置显微镜成像、Annexin V-FITC/PI双染、JC-1及DCFH-DA染色检测发现联合作用使肿瘤细胞的形态改变、细胞死亡比例、线粒体膜电位的降低程度及胞内ROS水平的增加均较单一药物或病毒作用更强,表明Forskolin与HSV-1联合具有抗肿瘤的生物学效应。4.通过RT-qPCR法对Forskolin与HSV-1联合作用LN229后的病毒复制相关基因的表达情况检测,发现Forskolin可使HSV-1的IE(ICP4)、E(UL12)和L(Us6)期基因表达升高。5.通过Western Blot检测Forskolin与HSV-1联合作用LN229后MAPKs信号通路的活化情况,发现联合作用后可降低p-c-Raf、p-ERK的表达,增加p-SPAK/JNK和p-p38的表达水平;表明联合作用可激活MAPK/p38和MAPK/JNK,抑制MAPK/ERK,但联合作用与HSV-1单独作用对MAPKs通路相关蛋白的活化水平相似,差异不显著。结论:本研究发现HSV-1可有效感染LN229细胞使其发生裂解性死亡,通过诱导ROS水平的增加,活化MAPKs中的JNK、p38和ERK通路,诱导细胞凋亡;同时阻滞细胞周期,抑制细胞增殖。Forskolin通过促进HSV-1复制基因的表达与HSV-1联合抑制LN229细胞增殖,发挥抗肿瘤生物学作用。综上,本研究为后续靶向GBM的OVs改造及OVs与小分子化合物联合抗肿瘤策略奠定了实验基础。