LncRNA出核关键蛋白的筛选及其促进出核机制探讨

作     者：赵思旗 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：雷海新

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：lncRNA 转运出核 exon junction complex(EJC) 原位荧光杂交 

摘      要：背景克里克提出的中心法则概念,将遗传物质的传递解释为从DNA到RNA,再从RNA传递至蛋白质,即实现遗传信息的转录以及翻译的过程。特定的DNA片断作为生物遗传信息模板,以依赖于DNA的RNA聚合酶作为催化剂,通过碱基互补的原则来合成m RNA前体。m RNA前体在细胞核内经过一系列的加工形成成熟m RNA,经过核孔复合体进入到细胞质中通过翻译产生蛋白质从而发挥生物功能。在这个过程中,成熟的m RNA能否顺利的转运出核对于蛋白质表达及功能发挥至关重要。已有研究发现,细胞中m RNA的转运出核是通过转录出核复合体(transcription-export,TREX)介导完成的,m RNA前体经过5’端加帽、去除内含子保留外显子的剪接,以及3’端加尾等过程形成成熟的m RNA,TREX复合体通过其组分Aly/REF与帽端结合蛋白CBP80相互作用从而富集到m RNA的5’端,之后与位于核膜附近的TAP/p15识别,在TAP/p15的介导下m RNA通过核孔复合体(nuclear pore complexes,NPCs)转运到细胞质中,完成出核过程。出核后的m RNA在细胞质中进入核糖体实现蛋白质的合成。除了能编码成蛋白发挥功能的m RNA,细胞中还存在大量不具备蛋白质编码能力的非编码RNA。人类基因组大约由30亿个碱基对所组成,但是仅有2%的基因序列被用于编码蛋白质,其余98%的基因序列都不能编码蛋白质。在这98%的非编码RNA大家族中,有一类长度大于200个核苷酸非编码RNA—长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)。Lnc RNA起初被认为是基因组转录的“噪音,是RNA聚合酶II转录的副产物,是不具有生物学功能的。但是随着对lnc RNA研究不断深入,越来越多的发现表明lnc RNA在众多细胞过程中发挥重要作用,并与多种疾病尤其是肿瘤的发生发展密切关联。作为RNA的一种,lnc RNA和m RNA在多个方面具有相似性。在加工方面,lnc RNA和m RNA都是由RNA聚合酶Ⅱ转录形成的;二者都具有5’端加帽和剪接事件;在细胞定位方面,m RNA分布在细胞质中,而不同的lnc RNA具有不同的核质分布,绝大多数的lnc RNA分布于细胞质中或者同时分布在细胞核和细胞质中,这表明它们是需要在转录完成以后从细胞核进入细胞质中发挥生物学功能的。目前对于lnc RNA的研究中岀核过程了解较少,其出核作用机制尚不明确。Lnc RNA与m RNA出核机制是否具有相似之处,又是否存在特异性在lnc RNA出核中发挥作用的蛋白?基于以上问题,本课题选取lnc RNA为研究对象,对其出核机制进行了深入研究及探讨,进一步完善lnc RNA出核机制。方法为了探究lnc RNA出核机制,本实验室前期工作中纯化了三种lnc RNA:ANCR、LINC00998以及GAS5在He La细胞核中结合蛋白,并对其进行质谱分析。本课题将在此基础上进一步研究:1)首先将已得到的lnc RNA结合蛋白进行丰度排序,挑选在质谱结果中相对富集的结合蛋白,运用Gene Ontology分析技术预测结合蛋白中的出核相关蛋白。2)利用RNA荧光原位杂交技术(RNA-fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)检测敲低预测蛋白后lnc RNA在报告基因水平的出核效果,确定lnc RNA出核关键蛋白。3)在内源水平通过RNA纯化结合RT-PCR技术对出核关键蛋白敲低后lnc RNA核质分布进行检测。结果本课题研究中,我们首先分析前期工作得到的lnc RNA结合蛋白质谱结果,运用生物信息学方法Gene Ontology分析技术进行蛋白功能预测得到29个出核相关蛋白,结合RNA-FISH实验筛选,找到了决定lnc RNA出核的关键反式作用因子外显子接合处结合蛋白复合体(exon junction complex,EJC)组份蛋白e IF4A3,并且发现e IF4A3对lnc RNA出核具有特异性促进作用。进一步将EJC的其他组份蛋白敲低筛选,发现在敲低Y14以及同时敲低MAGOH,MAGOB时,lnc RNA有明显出核抑制现象。得出EJC是lnc RNA出核关键复合体的初步结论,同时将这一结论在内源水平的实验中得到了验证。结论敲低EJC组份蛋白e IF4A3可以特异性抑制lnc RNA报告基因转录产物出核,但对两种m RNA报告基因转录产物的转运出核无明显影响。敲低其他EJC组份可同样导致lnc RNA报告基因转录产物出核阻滞。在内源性水平,EJC组份的敲低导致多种内源lnc RNA出现出核阻滞现象。这些结果表明EJC是lnc RNA转运出核关键蛋白复合体。