BET家族影响水牛支持细胞自噬的初步研究
作者单位：广西大学
学位级别：硕士
导师姓名：张明
授予年度：2022年
摘 要：水牛是一种优良的种质资源,是公认的最具有开发潜力和价值的家畜之一。但雄性水牛的繁殖力低于其他牛属物种,其中一个主要的原因是精子发生异常,这在一定程度上阻碍了水牛资源的开发。支持细胞（Sertoli Cells,SCs）是维持正常精子发生必不可少的一类体细胞,通过紧密连接、间隙连接和外质特化等方式构成血-睾丸屏障,在维持雄性繁殖力方面发挥重要作用。自噬是维持细胞稳态的重要机制,可以通过维护外质特化的完整性进而影响精子发生过程。BET（BRD and Extra-Terminal Domain）家族属于溴结构域（Bromodomain,BRD）家族,可作为自噬的调控因子,其受到抑制后会造成精子数量减少、精子活力降低并阻碍精子发生。因此,研究BET家族在支持细胞中的自噬调控机制具有重要价值。本研究以水牛支持细胞为研究对象,通过生物信息学手段分析BET家族的相关信息,并探究BET家族对水牛支持细胞自噬的影响及其潜在的调控机制,为进一步丰富BET家族调控网络以及研究精子发生的调控机制奠定理论基础。本研究的主要内容和结果如下:（1）水牛BRD家族鉴定和进化分析研究BET是BRD家族中的子家族,目前关于BET家族在水牛中的进化关系尚不清楚。为阐明BET家族的进化关系和功能,本试验采用生物信息学方法对水牛中所有BRD家族成员进行鉴定和进化分析。结果表明:在水牛基因组中鉴定出了22个BRD基因,共编码101个BRD蛋白质;BET家族成员位于同一分支上且亲缘关系密切,保守motif/结构域分析支持聚类的结果;在水牛BRD基因中未发现串联或节段重复事件,但20对BRD基因对在水牛和奶牛之间具有显著的同源性,其中包括BET家族,可能属于直系同源基因。以上结果为后续研究BET家族的功能奠定了理论基础。（2）抑制BET家族对水牛支持细胞自噬影响的研究本试验旨在研究抑制BET家族对水牛支持细胞自噬的影响。首先获得纯化的SCs,采用BET家族抑制剂JQ1处理SCs,筛选出最佳的作用浓度和时间,观察其对SCs形态、自噬和凋亡的影响。结果表明:500 n M和1000 n M的JQ1处理24 h对SCs活力产生明显的抑制作用,细胞形态发生明显变化;自噬体的数量增加,自噬溶酶体的降解被抑制,自噬通量减弱;细胞凋亡率无显著变化。以上结果表明,抑制BET家族导致自噬活性被抑制,对凋亡未产生显著影响,为进一步探索BET家族调控水牛SCs自噬的机制奠定了基础。（3）BET家族抑制前后的转录组分析及自噬调控机制的研究为进一步筛选自噬相关调控基因和信号通路,本试验通过转录组学鉴定抑制BET家族前后的差异表达基因,挖掘BET家族调控SCs自噬的潜在机制。结果表明:抑制BET家族前后的样品之间共筛选出2307个差异表达基因,其中上调基因639个,下调基因1614个;差异表达基因主要参与细胞通讯、信号转导、细胞进程调控等生物学进程以及Rap1、c AMP和TNF等信号通路,自噬相关差异表达基因主要参与自噬体的形成和成熟等生物学过程;蛋白质互作网络分析发现PIK3R1、PIK3CB、RRAS、FOXO3、ITPR1、HSPB8、p62、VAMP8在自噬调控中发挥枢纽作用。其中PIK3R1、PIK3CB在网络中的连接度最高,它们是PI3K-AKT信号通路的关键因子,推测PI3K-AKT信号通路可能在BET家族调控水牛SCs自噬的过程中发挥重要作用。q RT-PCR验证了VAMP8、FOXO3、ULK3、NRBF2、PIK3R1、PIK3CB和HSPB8的表达趋势与转录组数据一致。综上所述,本研究通过分析BET家族的进化关系,探究BET家族对水牛支持细胞自噬的影响及其潜在的调控机制,为研究BET家族各成员的功能和丰富BET家族调控网络提供新的依据,为进一步揭示微环境影响精子发生的机理提供参考。
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