ADAMDEC1通过降解THBS1促进胎盘滋养细胞合体化的机制研究

作     者：李卓航 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王应雄

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：胎盘 滋养细胞 合体化 ADAMDEC1 THBS1 子痫前期 

摘      要：研究目的:胎盘是连接母体及半异源性胎儿的重要纽带,其在整个妊娠期间保持高度动态变化以平衡母-胎免疫耐受和满足胎儿不同发育阶段营养物质的转运需求。滋养细胞作为胎盘的主要构成细胞,其中由细胞滋养细胞（Cytotrophoblast,CTB）不断增殖和分化为合体滋养层细胞（Syncytiotrophoblast,STB）以及绒毛外滋养细胞（Extravillous trophoblast,EVT）是实现胎盘动态变化的关键,但调控机制仍不甚明了。已有研究发现,细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）在滋养细胞分化及胎盘形成过程中广泛进行重塑,并参与母-胎信号转导、胎盘屏障构建及器官形态发生等,其异常将介导子痫前期（Preeclampsia,PE）、胎儿生长受限（Fetal growth restriction,FGR）和自然流产（Spontaneous abortion,SA）等胎盘源性妊娠疾病的发生与发展。因此,本研究从细胞外基质重塑调控细胞分化角度着手,拟阐明基质金属蛋白酶ADAMDEC1通过降解细胞外基质调控滋养细胞合体化的分子机制,及其异常与子痫前期发生的相关性,为揭示滋养细胞分化的调控机制提供理论依据,为子痫前期防治策略及药物研发提供潜在靶点。研究方法:本研究综合生物信息学分析、多种体外合体化模型、慢病毒转染系统、3D培养系统、蛋白质组学技术、临床关联性分析等研究手段,多方面探究ADAMDEC1对滋养细胞融合、细胞间边界重塑、信号转导的影响及其表达异常与子痫前期发生的相关性。首先,利用生物信息学方法从5个已发表的公共数据集中筛选出唯一共同上调基因ADAMDEC1,通过分离原代滋养细胞及收集正常早孕绒毛组织,采用实时荧光定量 PCR（Quantitative Reverse Transcription PCR,qRT-PCR）、免疫荧光（Immunofluorescence,IF）、蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）验证ADAMDEC1在CTB及STB中的表达模式;其次,通过慢病毒转染系统建立稳定敲低的BeWo细胞系、稳定过表达的BeWo细胞系和3DJEG-3细胞,联合福斯克林（Forskolin,FSK）诱导细胞融合构建合体化模型,采用 qRT-PCR、IF、WB、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）等实验技术探究ADAMDEC1降解THBS1介导滋养细胞融合的分子机制;再者,利用蛋白质组学技术挖掘ADAMDEC1在滋养细胞融合过程中其他潜在的底物,为进一步解析其参与ECM重塑提供研究靶标;最后,收集临床胎盘组织样本,采用IF、WB分析ADAMDEC1异常表达与PE发生的相关性。研究结果:一、滋养细胞融合差异表达基因筛选及分析通过对GEO数据库以及BioProject数据库中的5组滋养细胞合体化转录组数据集进行重分析,共获得6282个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,进一步维恩（Venn）分析发现ADAMDEC1是所有数据集中唯一共同上调表达的基因;通过“clusterProfiler软件分析包对DEGs进行基因本体（Gene ontology,GO）和KEGG信号通路富集分析,结果显示DEGs主要富集于细胞周期,参与类固醇合成、TNF介导的炎症信号通路、PI3K-Akt信号通路和Jak-STAT信号通路。二、原代滋养细胞验证DEGs及ADAMDEC1在胎盘组织的表达模式至少存在于2个数据集中的DEGs被认为是高度可信的基因,以此为标准共筛选出190个上调表达基因和406个下调表达基因。基于原代滋养细胞体外自发合体化模型对其中20个DEGs进行表达差异验证,实验统计结果与生物信息学分析结果一致,并且ADAMDEC1表达差异倍数高达23倍;进一步蛋白水平检测证实了原代滋养细胞体外培养48h后ADAMDEC1表达显著升高,且在早孕绒毛组织中显示相对高表达于外层STB。三、干扰ADAMDEC1表达抑制BeWo细胞合体化进程为了探究ADAMDEC1对滋养细胞合体化的影响,在BeWo细胞合体化模型上进行干扰ADAMDEC1表达实验,结果显示干扰抑制FSK诱导合体化标志物Syncytin1、β-hCG的上调表达以及降低BeWo细胞的融合效率。四、过表达ADAMDEC1促进BeWo细胞及3D JEG-3细胞融合基于经典的BeWo细胞合体化模型以及成功构建的3D合体化模型,发现单纯过表达ADAMDEC1在一定程度上促进了 BeWo细胞和3D JEG-3细胞核聚集,联合FSK处理显著上调合体化标志Syncytin1、β-hCG的表达并且更大程度地促进滋养细胞融合;同时发现在此过程中伴随着重要的细胞外基质蛋白表达降低,如钙粘附蛋白（Epithelial cadherin,E-cadherin）和血小板反应蛋白（Thrombospondin 1,THBS1）。五、ADAMDEC1通过降解THBS1激活cAMP信号通路为了确定THBS1和E-cadherin是否为ADAMDEC1的底物,在3D JEG-3细胞中利用Co-IP技术发现ADAMDEC1与THBS1之间存在蛋白质相互作用,而与E-cadherin没有直接互作关系;并且WB检测结果显示过表达ADAMDEC1增加了 BeWo细胞和3D JEG-3细胞的小分子THBS1丰度并且显著上调了 cAMP信号通路关键元件CREB和p-CREB的蛋白水平。六、蛋白质组学挖掘ADAMDEC1的潜在底物利用蛋白质组学技术分析过表达ADAMDEC1的3D JEG-3蛋白样本,以挖掘ADAMDEC1的其他潜在底物;共获得82个差异表达蛋白（Differentially expressed proteins,DEPs）,其中包括 54 个上调表达蛋白,28个下调表达蛋白。进一步的文献调研发现定位于细胞外基质的斯钙素 2（Stanniocalcin2,STC2）、共刺激分子 B7-H3（CD276）和干扰素刺激蛋白（Interferon stimulated protein,ISG15）可能作为ADAMDEC1的潜在底物并参与滋养细胞融合过程。七、ADAMDEC1异常低表达可能导致子痫前期的发生组织免疫荧光结果显示ADAMDEC1在子痫前期胎盘中的整体表达水平低于正常胎盘,进一步WB分析发现相较于正常胎盘组织,PE胎盘组织中ADAMDEC1以及合体化标志Syncytin1、β-hCG的蛋白水平显著降低,而THBS1呈现异常高表达。研究结论:本研究发现ADAMDEC1通过降解THBS1介导ECM重塑以及ECM-细胞信号转导,激活cAMP信号通路进而参与促进滋养细胞融合;更重要的是,ADAMDEC1的异常低表达可能导致滋养细胞融合受阻进而诱发子痫前期,这一发现有望为临床预测或治疗PE以及药物研发提供潜在的靶点。