TGEV和PEDV S基因部分表位区重组PRV毒株的构建及免疫效力初步探究

作     者：徐通 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈红英

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪传染性胃肠炎病毒 猪伪狂犬病毒 AD抗原表位区 CS中和表位区 重组病毒活载体疫苗 生物学特性 免疫效力 猪流行性腹泻病毒 

摘      要：猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)和猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)分别是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的。两者症状相似,包括仔猪腹泻、呕吐、厌食、脱水和体重减轻。2010年PEDV发生变异毒力增强,传统的PEDV疫苗株(CV777)无法提供完全保护,PEDV变异毒株在免疫CV777毒株的猪场仍然可以流行。这给生产上PEDV的预防带来很大的麻烦。猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染可导致神经紊乱、呼吸窘迫、体重减轻、幼猪死亡和妊娠母猪流产。自2011年底以来,中国许多地区出现大量PRV变异毒株,其与PRV经典毒株相比有更高的致病性。而且,经典的Bartha-K61疫苗不能完全保护仔猪免受这些新变异株的侵害。临床上经常存在TGEV、PEDV和PRV混合感染的现象。疫苗免疫仍是预防TGEV、PEDV变异毒株和PRV变异毒株的有效手段之一。因此,开发安全、有效的二或三联联疫苗对于预防TGEV、PEDV和PRV的感染具有重要意义。重组病毒在改进现有疫苗和开发新疫苗方面是一个特别有前途的途径。PRV基因组中存在大量的非必需基因,允许同时插入多个外源基因,可以获得同时针对多种疾病的疫苗。本研究以实验室保存的rPRV NY-g E/g I/TK毒株为亲本株构建表达TGEV S基因AD抗原表位区和共表达TGEV S基因AD抗原表位区和PEDV S基因CS中和表位区的两种重组病毒(rPRV-AD和rPRV-AD-CS)。此三缺失毒株(rPRV NY-g E/g I/TK)是以2012年底本实验室分离的PRV NY变异毒株为母本所构建。同时探究两种PRV重组毒株的生物学特性和免疫原性,以期获得安全有效的二联或三联疫苗的理想候选毒株。本研究通过Bam H I酶切位点将TGEV S基因中含A和D抗原位点的主要抗原表位区插入到pG转移质粒,构建转移质粒pG-AD-EGFP。转移质粒pG-AD-EGFP中含有PRV g G基因的相同序列作为同源臂。先将亲本毒株(rPRV NY-g E/g I/TK)接种ST细胞,然后将转移质粒pG-AD–EGFP转染至ST细胞。在ST细胞中亲本毒株与转移质粒发生同源重组。挑选绿色病变灶,经蚀斑纯化获得重组病毒rPRV-AD-EGFP。利用CRISPR/Cas9双敲载体将EGFP敲除,得到重组病毒rPRV-AD。在转录水平和表达水平对重组病毒rPRV-AD鉴定,结果表明rPRV-AD在ST细胞上成功表达AD抗原表位区。将PEDV CS中和表位区经Bam H I和Hind III酶切位点插入真核表达载体pBApo-EF1α＿Pur＿DNA,同时在CS中和表位区前引入Koza K序列(GCCACC),获得真核表达质粒pBA-CS。用Bstz17I酶将转移质粒pG-AD-EGFP酶切成线性载体。线性载体两端各20 bp左右作为同源臂引入扩增CS表达盒引物的两端,以真核表达质粒pBA-CS为模板扩增出CS中和表位区表达盒。用无缝克隆技术将CS表达盒连接至线性载体,成功构建转移质粒pG-AD-CS-EGFP。将亲本株(rPRV NY-g E/g I/TK)接种ST细胞,再将转移质粒(pG-AD-CS-EGFP)转染至ST细胞。挑选绿色病变灶,经蚀斑纯化获得重组毒rPRV-AD-CS-EGFP。利用CRISPR/Cas9双敲载体将EGFP敲除,经蚀斑纯化得到重组病毒rPRV-AD-CS。经RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光试验鉴定,重组病毒rPRV-AD-CS成功表达CS中和表位区。重组病毒(rPRV-AD和rPRV-AD-CS)与亲本毒株(rPRV NY-g E/g I/TK)在ST细胞上有相似的培养特性,在四种不同细胞上的病毒滴度相似,一步生长曲线增长趋势基本一致,理化特性一致,而且具有遗传稳定性。将2个重组病毒毒株免疫3周龄仔猪后,仔猪体温、体重增长量、采食量和精神状态均正常,表明其对仔猪是安全的。经ELISA和中和试验表明,重组病毒均能刺激仔猪产生针对PRV、TGEV和PEDV的免疫应答。针对TGEV和PEDV的免疫效果低于商品化二联弱毒苗,而针对PRV的免疫效果与商品化疫苗基本相同。攻毒试验结果表明,重组病毒(rPRV-AD和rPRV-AD-CS)对TGEV强毒株有一定的保护效果,重组病毒(rPRV-AD-CS)对PEDV强毒株有一定的保护效果,但是保护效果均低于商品化二联弱毒苗。本试验中每组动物数偏少,只能初步显示重组