异常球菌S9（Deinococcus sp. S9）源重组RecA和RecN蛋白表达及活性分析

作     者：秦鑫 

作者单位：内蒙古大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李昕宇

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：Deinococcus sp.S9 RecA RecN ATP酶活性 荧光各向异性 

摘      要：异常球菌S9(Deinococcus sp.S9)是一种红色嗜热细菌,对辐射、温度和重金属具有较强抗性,同时具有较高的DNA损伤修复率,因为该细菌基因组包含DNA修复和抗辐射的基因,例如rec A、rec N、rec F和rec R。本文利用分子生物学和生物信息学方法,研究了Deinococcus sp.S9源RecA和RecN蛋白的氨基酸序列、表达、纯化及活性,为RecA和RecN蛋白的功能以及RecA和RecN在DNA双链修复过程中发挥的作用提供了参考依据。主要获得以下成果:(1)对Deinococcus sp.S9源的rec A和rec N基因进行载体构建,诱导表达、纯化,获得高纯度的RecA和RecN蛋白。(2)利用圆二色光谱仪测定了RecA和RecN蛋白的圆二色性及热性能。RecA和RecN在碱性条件下,均可维持其稳定的二级结构,而在酸性条件中,蛋白二级结构发生了变化;其中RecA热转变温度(Tm)为53.75℃,RecN热转变温度(Tm)为57℃。(3)基于NaK-ATP酶活性测定,分析RecA和RecN蛋白的ATP酶活性。结果显示,RecA在p H3.5和p H7.4条件下酶活性较高,但在p H10、3.4 m M Co和3.4 m M Mn溶液条件下,ATP酶活性明显减弱。RecN蛋白在p H3.5、p H10、3.4 m M Co和3.4 m M Mn溶液条件下,ATP酶活性都明显减弱。(4)基于荧光各向异性方法,分析RecA和RecN对DNA底物的结合活性。结果显示RecA和RecN对K、Mg及ATP都有一定的偏好性;lssDNA和lds DNA序列越长其结合能力越强。(5)对RecA和RecN蛋白进行生物信息学分析。经分析,RecA蛋白的分子式为CHNOS,磷酸化位点共有29处、二级结构主要以α-螺旋(Hh,40.78%)和无规则卷曲(Cc,33.52%)为主、该蛋白有7个高疏水性区域、5个高亲水性区域,证明了RecA蛋白为亲水性蛋白。RecN蛋白的分子式为CHNOS、磷酸化位点共有41处、该蛋白有4个高疏水性区域、5个高亲水性区域,证明了RecN蛋白为亲水性蛋白;蛋白二级结构主要以α-螺旋(Hh,63.32%)和无规则卷曲(Cc,21.98%)为主。最后对RecA和RecN蛋白相互作用进行预测分析。预测结果显示RecA蛋白的第122位Arg与RecN蛋白的第242位Gln两者间会形成一个氢键,我们猜测在DSBs修复中,RecA阻止RecN从ss DNA上分离,这与Arg和Gln间形成的氢键有关。本研究优化了Deinococcus sp.S9源RecA和RecN的原核表达及纯化,初步探索了RecA和RecN蛋白圆二色性及热性能、ATP酶活性及与核酸的结合活性,为更加全面的了解RecA和RecN蛋白的功能及二者之间的相互作用提供一些参考和依据。