枸杞多糖通过Nrf2信号通路和过氧化物酶体活性协同提高体外成熟猪卵母细胞抗氧化能力的初步研究

作     者：田钗 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李湘萍

授予年度：2022年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：枸杞多糖 卵母细胞 体外成熟 过氧化物酶体 Nrf2 

摘      要：卵母细胞体外成熟（IVM）是动物胚胎生物技术的重要环节,已经应用在体外受精、核移植和转基因动物技术等多方面。影响卵母细胞体外成熟的因素有很多,如培养环境条件、成熟液营养成分、培养时间等。大量研究发现体外培养过程中产生的活性氧（ROS）累积可能会造成卵母细胞的氧化应激,使卵母细胞成熟阻滞、减数分裂异常,导致受精或激活后胚胎发育停滞、胚胎死亡等现象。枸杞多糖（LBP）作为枸杞提取物的活性成分,具有抗氧化、抗衰老、消炎等功效,已被证实可以降低玻璃化冷冻小鼠卵母细胞内ROS含量,推测其也可以降低体外成熟卵母细胞的氧化应激。基于此,我们对枸杞多糖在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育过程中的作用及机制进行了探索,本研究取得以下结果:1、枸杞多糖对猪卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响。结果显示,与未处理组相比,成熟培养液中添加100μg/m L的LBP可以显著提高卵母细胞第一极体排出率、IVF胚胎的分裂率、4-细胞率和囊胚率（P0.05）。用DCFH-DA染色液检测卵母细胞的ROS含量,发现与未处理组相比,100μg/m L LBP处理的卵母细胞的ROS含量显著降低,200μg/m L组的ROS含量显著升高（P0.05）。100μg/m L处理可以显著提高猪卵母细胞GSH-Px酶活力（P0.05）,200μg/m L组无差异（P0.05）。卵丘细胞扩展指数分析发现,100μg/m L浓度的LBP对卵丘细胞扩展具有促进作用（P0.05）,后续采用100μg/m L的LBP进行处理。和未处理组相比,LBP显著降低了猪卵母细胞的多精入卵率,并显著提高了单精入卵率（P0.05）。q RT-PCR检测结果显示,LBP使抗氧化相关基因CAT、SOD1、GPX4和细胞凋亡抑制基因BCL2表达水平显著上调,凋亡基因BAX的表达显著下调（P0.05）。2、枸杞多糖通过Nrf2信号通路和过氧化物酶体活性协同提高猪卵母细胞抗氧化作用初步探讨。在猪卵母细胞体外成熟过程中添加不同浓度Nrf2特异性抑制剂Brusatol,发现与未处理组相比,4 n M Brusatol显著降低了猪卵母细胞的第一极体排出率（73.27 VS 62.6）、IVF胚胎的分裂率（46.53 VS 35.51）、4-细胞率（40.59 VS 29.90）、囊胚率（11.88VS 7.47）（P0.05）。4 n M Brusatol对猪卵丘细胞扩展的抑制作用显著（P0.05）。q RT-PCR结果发现,LBP处理显著提高了Nrf2以及过氧化物酶体活性相关基因PEX3、PEX5、PEX19、PHYH、PPARγ的表达（P0.05）。免疫荧光结果显示,与未处理组相比,LBP单独处理及与Brusatol联合处理显著提高了猪卵母细胞Nrf2的表达（P0.05）,Brusatol组的Nrf2表达显著降低（P0.05）。以上结果表明,添加适宜浓度LBP能提高猪卵母细胞体外成熟效率和早期胚胎发育潜力;LBP可能通过激活Nrf2信号通路及增强过氧化物酶体活性来发挥作用。