铁皮石斛DoHMGR、DoMK的克隆与功能分析

作     者：崔曼丽 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林毅

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：铁皮石斛 基因克隆 启动子 MYB转录因子 表达分析 

摘      要：铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科草本植物,是我国重要的中药材品种,可益胃生津、滋阴清热,其主要药用成分为萜类吲哚生物碱、多糖、氨基酸。MVA途径是生成萜类吲哚生物碱前体物质的重要途径之一,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）和甲羟戊酸激酶（MK）是存在于胞质MVA途径中的关键限速酶,其研究十分重要。本文克隆得到DoHMGR和DoMK全长cDNA和启动子序列,筛选铁皮石斛MYB家族成员,丰富MYB类转录因子数据库,以期为后续深入研究铁皮石斛萜类合成途径奠定理论基础。主要结果如下:1.利用同源克隆与RACE的方法克隆得到DoHMGR和DoMK（GeneBank登录号为MF536713）。组织表达与诱导表达分析表明,DoHMGR和DoMK在铁皮石斛的各个组织部位中均有表达,在以原球茎为材料的诱导表达中共同响应水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）诱导表达。2.克隆得到DoHMGR与DoMK启动子序列,软件分析表明,启动子区含有多种顺式作用元件,其中含有多个MYB结合元件。3.筛选得到101个R2R3-MYB基因,根据聚类分析分为25个亚家族（S1-S25）,并进行生物信息学分析。挑选其中6个亚家族成员进行组织表达分析与激素诱导表达分析。并对其中两个基因进行同源克隆,得到DoMYB29和DoMYB31基因序列。4.pCAMBIA1301-DoHMGR和 pCAMBIA1 301-DoMK真核表达载体成功构建,农杆菌介导下转化野生拟南芥,筛选得到T3代稳定过表达植株,检测其表型与野生型差异,T3代转基因DoHMGR拟南芥植株下胚轴较野生型下胚轴短。