EV71 3C蛋白调控内质网应激反应的初步研究

作     者：郭德轩 

作者单位：黑龙江八一农垦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张华

授予年度：2022年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：肠道病毒71型 3C蛋白 内质网应激 

摘      要：肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员,该病毒感染引起婴幼儿手足口病,引起脑膜炎、脑干脑炎等神经系统病变,甚至死亡。EV71病毒基因组编码11个蛋白,包括4个结构蛋白（VP1-VP4）和7个非结构蛋白（2A-2C和3A-3D）。有研究表明,EV71的致病性与其诱导宿主细胞的应激反应有关。作为一种重要的蛋白酶,3C蛋白在病毒生命过程发挥重要的作用。我们前期研究表明,3C蛋白可以通过调控宿主细胞的内质网应激反应来影响病毒的复制,但其具体过程和确切机制尚不清楚。基于上述研究基础,本论文开展了如下研究:（1）本研究首先验证EV71病毒对不同细胞的感染力,用EV71病毒将He La、HEK-293T和RD细胞感染,在不同时间点,用Western Blot技术与间接免疫荧光技术检测病毒的表达情况。结果显示,EV71病毒感染6 h后,可以检测到病毒蛋白VP1的表达,说明EV71病毒可以感染上述3种细胞。为了研究EV71病毒对内质网应激反应的影响,EV71病毒感染细胞后,在不同时间点,Western Blot技术和RT-PCR技术检测PERK、IRE1和ATF6的活化情况。结果显示,EV71病毒在感染后期显著增强PERK、e IF2α和IRE1的磷酸化,但并未引起XBP1的剪接。此外,EV71病毒抑制GRP78的蛋白表达,上调ATF6蛋白表达。这些结果说明,EV71病毒在感染后期激活PERK-e IF2α信号通路、抑制ATF6信号通路,但对IRE1-XBP1通路没有影响。（2）采用基因克隆技术构建了EV71 3C蛋白的真核表达载体,利用Western blot技术验证了3C蛋白的正确表达,并通过间接免疫荧光技术检测细胞定位情况。结果显示,3C蛋白主要定位于细胞质,未与内质网发生共定位。有研究表明,内质网应激往往由非折叠蛋白反应而导致的。为了研究3C蛋白对内质网应激反应的影响,本研究通过Western blot和RT-PCR技术检测3C蛋白对GRP78、PERK、ATF6蛋白表达与XBP1剪切情况,以及对下游信号基因的转录影响。结果显示,3C蛋白可以抑制GRP78蛋白表达以及转录水平,下调了PERK和e IF2α的磷酸化水平,上调了ATF6蛋白表达,并未诱导XBP1的剪切,且对下游信号相关基因（ATF4、CHOP等）的转录没有显著影响。这些结果表明,EV71 3C蛋白抑制PERK-e IF2α和ATF6信号通路,并阻断了PERK和ATF6下游信号的传递。（3）构建融合GST标签的原核表达载体,诱导表达并纯化了GST-3C蛋白。采用GST pull down技术,研究3C蛋白与内质网应激反应中相关蛋白的互作情况。结果显示,3C蛋白未能捕获内质网应激反应相关蛋白。同时,通过过表达3C蛋白及其相关内质网应激蛋白,Co IP技术验证其相互作用,结果显示,3C蛋白不能共沉淀内网应激反应相关蛋白。这些结果说明,EV71 3C蛋白未与内质网应激反应中相关蛋白发生互作。（4）有研究报道,内质网应激反应具有调控病毒复制的生物学功能。为了研究3C蛋白通过抑制调控内质网应激反应调控病毒复制的具体作用,在细胞中过表达3C蛋白之后,感染EV71病毒,在指定的时间点检测病毒复制情况。结果显示,3C蛋白下调GRP78蛋白表达、上调ATF6蛋白表达,对XBP1剪接无影响。此外,3C蛋白还引起了PERK磷酸化,对e IF2α磷酸化无影响,这可能是3C蛋白与EV71病毒感染共同作用的结果。重要的是,本研究发现EV71病毒的VP1蛋白的表达以及转录水平明显增加。上述结果说明,在病毒感染后期,EV713C蛋白可以抑制内质网应激反应的PERK/e IF2α和ATF6信号通路,促进EV71病毒的复制。综上所述,本研究初步证实,EV71 3C蛋白对IRE1/XBP1途径无影响,而具有阻断PERK/e IF2α和ATF6途径的作用。EV71 3C蛋白可以通过抑制内质网应激反应从而增强了EV71病毒的复制水平。本研究解析了EV71 3C蛋白调控内质网应激反应的新功能,不仅有助于增加EV71与宿主相互作用的新观点,而且有助于提出针对内质网应激拮抗病毒复制的新策略。