猪场内不同来源肠球菌optrA基因的传播机制

作     者：李幸运 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杜向党

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：肠球菌 optrA Tn6674 流行特征 基因水平转移 

摘      要：肠球菌(Enterococcus)广泛存在于土壤,植物,人类和动物胃肠道,是一种重要的革兰氏阳性条件致病菌。同时,肠球菌被认为是多种耐药基因的储存库,能够加速耐药基因的扩散传播。养殖业因细菌耐药而导致的治疗失败,不仅影响经济效益,而且对人类健康也造成巨大威胁。optr A基因是一种最近发现的可同时介导酰胺醇类药物(动物专用)和恶唑烷酮类药物(医用)耐药的基因,自2015年首次发现以来,在世界范围内的医学临床、养殖动物、屠宰场、零售肉制品等多种来源分离的菌株中均有报道。本研究从某规模化猪场采集猪、鸟和养殖人员的粪便、苍蝇、蜘蛛、污水、饮用水样本,分离鉴定肠球菌。通过PCR检测、药物敏感性试验、全基因组测序、耐药基因型分析、MLST分型、核心基因组单核苷酸多态性分析、接合试验、S1-PFGE和Southern blot等技术手段,探讨在规模化生猪养殖模式条件下的局部生态环境中,optr A基因及携带该基因的可移动遗传元件的水平传播特征及传播机制。种属鉴定结果显示,共分离到158株肠球菌,其中粪肠球菌137株、屎肠球菌1株、铅黄肠球菌14株、鹑鸡肠球菌3株、海氏肠球菌1株,鸟肠球菌2株。optr A基因筛查结果显示,共有125株optr A阳性菌,其中,粪肠球菌106株,屎肠球菌1株,铅黄肠球菌14株,鹑鸡肠球菌4株,鸟肠球菌1株。采用肉汤稀释法测定optr A阳性肠球菌对10种抗菌药物的敏感性,结果显示,所有的optr A阳性肠球菌对替加环素和万古霉素敏感,对其它几类抗生素表现出不同程度的耐药性。根据optr A阳性肠球菌全基因组测序结果进行耐药基因型分析,发现肠球菌耐药表型与耐药基因携带情况一致且存在一种耐药谱型对应多种耐药基因型的情况。optr A阳性粪肠球菌和屎肠球菌多位点序列分型(MLST)结果显示,除获得18个已知ST型外,还获得了10个新ST型。其中,ST691是主要流行ST型,宿主来源也最丰富。对106株optr A阳性粪肠球菌进行亲缘关系分析,发现猪、水、鸟、蜘蛛来源的部分粪肠球菌亲缘关系相近,提示optr A阳性粪肠球菌能够在养殖场范围内不同宿主之间传播;同一宿主来源的optr A阳性粪肠球菌亲缘关系复杂,提示optr A基因可能在这些菌株间发生水平转移。对optr A阳性肠球菌进行optr A基因遗传环境分析,结果显示optr A基因定位于Tn6674/Tn6674-like的比例为71/106。携带Tn6674/Tn6674-like的粪肠球菌分属多个ST型,亲缘关系复杂,同时分布于所有来源。选择携带Tn6674/Tn6674-like的不同来源、不同ST型的粪肠球菌为供体菌进行接合转移试验,结果显示,接合转移频率的范围是7.3×10-3.5×10。利用16S r RNA测序、MLST分型、重叠PCR和药敏试验验证接合子,结果显示,不同来源、不同ST型粪肠球菌中的Tn6674/Tn6674-like均可发生接合转移,对野生株和接合子进行S1-PFGE、Southern blot和三代测序验证,证实Tn6674/Tn6674-like位于染色体上,在接合过程中通过同源重组的方式水平转移至受体菌株的染色体。综上所述,本研究发现optr A阳性肠球菌在该规模化猪养殖场中广泛流行,且optr A阳性肠球菌多重耐药情况严重;通过MLST分型和核心基因组单核苷酸多态性分析,发现optr A阳性粪肠球菌在猪场范围内不同宿主间可能发生交互传播,水源(饮水、污水)、虫媒(蜘蛛)、鸟等环境介质在生猪养殖场内optr A基因的传播中可能发挥重要作用;对optr A遗传环境分析以及Tn6674/Tn6674-like可转移性分析,揭示了Tn6674/Tn6674-like发生水平转移的分子机制。