拟除虫菊酯降解酶表面展示工程菌的构建及其应用研究

作     者：陆柳萃 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐爱星

授予年度：2022年

学科分类：082803[工学-农业生物环境与能源工程] 07[理学] 08[工学] 0828[工学-农业工程] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：细胞表面展示 大肠杆菌 酿酒酵母 拟除虫菊酯降解酶 农药降解 

摘      要：拟除虫菊酯类农药是目前世界上使用最广泛的杀虫剂之一,在环境中的残留和积累,给人类健康和生态系统造成了巨大的威胁。生物降解因为其高效、安全、无二次污染,已成为农药残留修复的有效措施。本研究基于细胞表面展示技术,以来源于铜绿假单胞菌GF31的拟除虫菊酯降解酶(Aps)作为目的蛋白,尝试构建大肠杆菌和酿酒酵母表面展示工程菌,对其进行工程优化并应用于环境中残留拟除虫菊酯农药的去除。大肠杆菌具有清晰的遗传背景、简单成熟的遗传操作技术令其在表面展示系统中有着独特的优势。本研究通过筛选表达质粒、载体蛋白和宿主菌,最终获得六种具有活性的大肠杆菌表面展示工程菌,其中活性最高的是工程菌R-22b-InaKN-Aps,活性达到0.16 U/OD/mL。然后采用细胞分级分离电泳和免疫荧光分析等技术证明了融合蛋白InaKN-Aps准确定位在大肠杆菌的细胞表面,表明成功构建了拟除虫菊酯降解酶Aps的大肠杆菌表面展示工程菌。酿酒酵母菌因其生态安全性使其能够应用于食品及环境工业。本研究通过N端和C端融合的方式,构建了两种具有活性的酿酒酵母表面展示工程菌EBY100-pYD1-Aga2N-Aps和EBY100-pYD1-Aga2C-Aps,其酶活性分别为0.25 U/OD/mL和0.12 U/OD/mL。采用Western blot、免疫荧光分析和流式细胞分选等技术证明了融合蛋白Aga2-Aps准确定位在酿酒酵母的细胞表面,表明成功构建了拟除虫菊酯降解酶Aps的酿酒酵母表面展示工程菌。对构建的表面展示工程菌进行催化工艺优化,结果表明,三种表面展示工程菌(R-22b-InaKN-Aps、EBY100-pYD1-Aga2N-Aps和EBY100-pYD1-Aga2C-Aps)的最适反应温度为60℃,最适pH为9.0,且在最适条件下重复利用十个批次后,均能保持初始酶活性的70%以上,具有良好的可重复利用性;三种工程菌均能能降解五种常用的拟除虫菊酯农药,具有良好的底物广谱性,其中对高效氯氰菊酯的降解效果最好,降解速率分别为35.9μmol·L·d,33.16μmol·L·d和28.99μmol·L·d。进一步研究发现,工程菌EBY100-pYD1-Aga2N-Aps和EBY100-pYD1-Aga2C-Aps可作为洗涤剂去除生菜和樱桃番茄中残留的高效氯氰菊酯农药,为食品加工工业和家庭的果蔬农药残留去除提供一种新选择。本研究利用表面展示技术,以拟除虫菊酯降解酶Aps作为目的蛋白,构建了细菌和真菌两种表面展示系统,获得三种新型的表面展示工程菌,具有比原始菌株GF31更高的降解活性。与直接利用降解酶相比,表面展示工程菌可重复使用,且价格更低廉。本研究为拟除虫菊酯类农药的原位生物修复提供理论基础,也为其它疏水性有机污染物的环境生物修复提供有益的借鉴。