氢醌诱导肝细胞自噬及其与DNA损伤应答的关系研究

作     者：郑作兵 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡恭华

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：氢醌 自噬 DNA损伤应答 肝细胞 

摘      要：目的:探讨氢醌对肝细胞自噬水平的影响,明确自噬在氢醌所致肝细胞DNA损伤应答（DNA Damage Response,DDR）中的作用及其机制;为深入阐明氢醌中毒的分子机制,寻找氢醌职业中毒的干预靶点提供新思路,并为建立机体对氢醌所致损伤的防御体系提供科学的理论依据。方法:（1）氢醌作用下肝细胞的自噬状况分析:不同浓度HQ作用L02肝细胞24小时,采用透射电镜观察自噬体形成,m Cherry-GFP-LC3B融合蛋白示踪自噬体形成,Western blot实验检测自噬标志蛋白LC3、Beclin-1、P62的表达,免疫荧光实验检测自噬蛋白LC3、Beclin-1、P62的亚细胞定位及表达。（2）自噬对氢醌作用下肝细胞DDR的影响:自噬抑制剂或自噬诱导剂联合HQ作用肝细胞后,采用相差倒置显微镜观察细胞状态,检测细胞线粒体膜电位水平和ATP含量,采用流式细胞术检测细胞周期分布、凋亡水平,采用彗星实验检测细胞DNA损伤状况,Western blot实验检测DDR相关蛋白的表达,免疫荧光实验检测DDR相关蛋白的亚细胞定位及表达。结果:（1）氢醌作用下肝细胞的自噬状况分析:透射电镜下观察到HQ作用L02肝细胞后出现自噬样改变,自噬体和自噬溶酶体结构较对照组显著增多。m Cherry-GFP-LC3B实验结果显示,HQ组以剂量依赖性的方式增加了代表自噬体的黄色荧光斑点的数量,而代表自噬溶酶体的红色片状斑点有明显减少的趋势。Western blot结果显示,与对照组相比,HQ组提高了LC3II/LC3I的蛋白质表达水平;但对Beclin-1和P62蛋白表达无显著影响。免疫荧光结果显示,LC3蛋白在细胞核和细胞质中均有表达,主要分布于细胞核中,HQ处理后LC3在细胞核周围聚集,荧光强度均明显高于对照组;Beclin-1在细胞核和细胞质均有表达,HQ组Beclin-1的亚细胞定位及荧光强度与对照组无明显差异;在对照组和低剂量HQ组（10和20μmol/L）中,P62蛋白只在细胞质中表达,而在高剂量HQ组中,观察到P62蛋白在细胞质与细胞核中均有表达。（2）自噬对氢醌作用下肝细胞DDR的影响:单纯的自噬抑制剂或诱导剂对肝细胞形态学特征和细胞活力的影响不显著,自噬抑制或诱导下不增加HQ的细胞毒性。细胞凋亡检测结果显示,对照组、HQ组、3-MA组、3-MA+HQ组、Rapa组、Rapa+HQ组的细胞凋亡率分别为6.17%、19.70%、6.63%、12.20%、9.54%和19.2%。与对照组相比,HQ组、3-MA+HQ组、Rapa组、Rapa+HQ组的细胞凋亡率升高（P0.01）;3-MA+HQ组的细胞凋亡率明显低于HQ组（P0.05）。细胞周期检测结果显示,对照组、HQ组、3-MA组、3-MA+HQ组、Rapa组、Rapa+HQ组G1期细胞比例分别为83.3%、78.2%、76.7%、69.9%、82.1%和78.9%;S期细胞比例分别为9.9%、14.5%、15.1%、21.7%、10.6%和14.0%;G2期细胞比例分别为4.3%、4.8%、6.0%、6.8%、4.9%和5.0%。与对照组相比,HQ组、3-MA组、3-MA+HQ组和Rapa+HQ组G1期细胞比例降低（P0.05）;HQ组、3-MA组、3-MA+HQ组和Rapa+HQ组S期细胞比例增加（P0.05）;3-MA+HQ组G2期细胞比例增加（P0.05）。与HQ组相比,3-MA+HQ组的G1期细胞比例降低（P0.01）,G2期和S期细胞比例升高（P0.05）。细胞线粒体膜电位检测结果显示,对照组、HQ组、3-MA组、3-MA+HQ组、Rapa组、Rapa+HQ组线粒体膜电位水平分别为7.80、5.57、8.66、6.72、8.15、5.66。与对照组相比,HQ组、3-MA+HQ组和Rapa+HQ组线粒体膜电位下降（P0.01）;3-MA组线粒体膜电位升高（P0.05）。与HQ组相比,3-MA+HQ组线粒体膜电位升高（P0.01）。ATP检测结果显示,对照组、HQ组、3-MA组、3-MA+HQ组、Rapa组、Rapa+HQ组的细胞ATP含量依次为9.45、9.63、8.90、9.43、9.95和10.95μM/g蛋白,Rapa+HQ组的ATP含量高于对照组和HQ组（P0.05）。彗星实验结果显示,HQ组、3-MA+HQ组和Rapa+HQ组均能诱导肝细胞DNA损伤水平的增加,Rapa+HQ组较HQ组的DNA损伤水平降低（P0.01）。Western blot结果显示,与HQ组相比,3-MA+HQ组的p-DNA-PKcs、PARP1、Chk1、p-Chk2蛋白表达上调,但下调了Chk2和p-p53的表达;Rapa+HQ组的DNA-PKcs、p-DNA-PKcs、PARP1蛋白表达上调,但下调了p-p53、Chk1、p-Chk1和p-Chk2的表达。细胞免疫荧光结果显示各目的蛋白的荧光强度表达与Western blot实验的结果基本相符,各处理组DDR蛋白亚细胞定位特征未发生明显改变。结论:（1）HQ能够引起L02细胞自噬水平的增加。（2）抑制自噬降低了HQ对L02细胞的凋亡作用,升高了HQ处理后细胞线粒体膜电位水平,增强了HQ对细胞周期S期和G2期的阻滞作用。（3）诱导自噬提高了HQ处理下细胞的ATP水平,并在一定程度上降低HQ对L02细胞的DNA损伤。（4）自噬可能通过调节DNA-PKcs、PARP1、Chk1、Chk2、p53的表达和/或活性而对HQ诱导的肝细胞DDR状况产生影响。