十二指肠贾第虫端粒酶RNA结合域TRBD互作蛋白的筛选及功能研究

作     者：明珠 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张西臣

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：十二指肠贾第虫 端粒酶 TRBD 酵母双杂交 

摘      要：十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis),简称贾第虫(Giardia),是一种重要的人兽共患寄生虫,广泛寄生于人和哺乳动物,能够引起腹泻等肠道疾病,感染率高,严重危害人类及动物健康。临床上用于治疗贾第虫的药物主要有甲硝唑,替硝唑等,但频繁使用抗贾第虫药物易存在致畸致癌的危险,目前尚无有效的防治药物及疫苗。究其原因是对贾第虫分子生物学特性及细胞周期调节机制缺乏了解。因此,进一步探索贾第虫生命周期调节机制并寻找良好的药物作用靶标具有重要的现实意义。贾第虫被认为是原核生物和真核生物的过渡阶段,可作为一种理想的真核“模式生物。其滋养体具有大小形态相似的两个细胞核,已有研究表明二者能够同步进行DNA复制及转录,但关于两个细胞核是否具有相同的基因和功能仍存在争议。贾第虫以二分裂方式增殖,能够进行体外纯培养及反复传代,呈“永生化现象。而大量研究显示,细胞的永生化与端粒-端粒酶调控有关。端粒酶(Telomerase)是一种具有逆转录酶活性的核糖核酸-蛋白质复合物,它通过合成端粒DNA以延长端粒末端,维持端粒长度及稳定,且参与细胞死亡、衰老等生命进程。端粒酶逆转录酶(TERT)是具有催化活性的端粒酶亚单位,其含有一个高度保守的结构域,即端粒酶RNA结合域(TRBD),主要参与核糖体蛋白复合物的组装,对端粒酶活性至关重要。目前,有报道显示贾第虫端粒酶TRBD与RFC1、ZFD蛋白均有相互作用,从而正向调节贾第虫端粒酶活性并影响虫体增殖。由于贾第虫端粒酶活性调节是复杂的调控过程,可能需要多种蛋白质的共同作用,因此筛选并研究新的端粒酶相关蛋白的功能有利于揭示贾第虫端粒酶调控网络以及深入研究贾第虫细胞周期调节机制。故本研究利用酵母双杂交系统筛选十二指肠贾第虫端粒酶RNA结合域TRBD的互作蛋白,通过双分子荧光互补技术,免疫共沉淀等方法验证二者的相互作用,利用免疫荧光及Duolink(?)PLA方法确定二者在贾第虫内的定位情况,并探究端粒酶TRBD互作蛋白对于贾第虫端粒酶活性的影响,为进一步探索贾第虫端粒酶调控机制奠定基础。十二指肠贾第虫TRBD互作蛋白的筛选:构建诱饵质粒p GBKT7-TRBD并转化至Y2H Gold酵母感受态中进行毒性及自激活检测。然后,将诱饵质粒与十二指肠贾第虫酵母双杂交c DNA质粒文库共转化至酵母感受态中,通过不同营养缺陷型培养基进行筛选。试验结果表明诱饵质粒p GBKT7-TRBD对酵母细胞无毒性作用且不能引起自激活现象,同时利用酵母双杂交系统初步筛选得到5个阳性克隆,即Histone acetyltransferase type B subunit 2、b ZIP family protein、WD-repeat protein、NHLrepeat-containing protein、Heat shock protein 90,经回返验证得到TRBD的互作蛋白Heat shock protein 90(Hsp90)。十二指肠贾第虫TRBD与Hsp90相互作用的验证:首先,构建双分子荧光重组质粒pb Jun-Hsp90和pb Fos-TRBD,将二者共转染至HEK-293T细胞中,通过双分子荧光互补试验观察到红色荧光,说明TRBD与Hsp90在细胞内存在相互作用。随后,构建p CDNA3.1-His-TRBD和p CDNA3.1-HA-Hsp90真核表达质粒并共转染至HEK-293T细胞中,收取蛋白并进行免疫共沉淀验证,试验结果表明TRBD与Hsp90在细胞内存在相互作用。最后,构建p ET-32a-TRBD和p GEX-4T-1-Hsp90重组质粒并诱导蛋白表达及纯化,GST-Pull down结果表明TRBD与Hsp90存在相互作用。十二指肠贾第虫TRBD与Hsp90蛋白在贾第虫中的定位:首先制备鼠抗TRBD及兔抗Hsp90多克隆抗体,利用免疫荧光技术观察TRBD与Hsp90在贾第虫中的分布情况,并通过Duolink(?)PLA观察二者在贾第虫双核中的共定位。试验结果表明TRBD存在于贾第虫细胞核和细胞质中,而Hsp90则主要弥散性地分布在细胞质中,少部分存在于细胞核中;且TRBD与Hsp90共定位于贾第虫双核上。十二指肠贾第虫端粒酶互作蛋白Hsp90对端粒酶活性的影响:构建十二指肠贾第虫病毒载体介导的锤头状核酶重组质粒并进行体外切割试验,Real-Time PCR结果显示其体外切割效率达到69.83%。将含有锤头状核酶的重组质粒分别电转染至贾第虫滋养体内,通过Real-Time PCR和Western Blot检测到p C631-pac-Ham-Hsp90电转组中Hsp90的转录子含量为对照组的46.1%,Hsp90蛋白的表达水平降低,且虫体增殖速度变慢;TRAP-银染法检测到p C631-pac-Ham-Hsp90电转组中端粒酶的活性也明显降低。试验结果表明Hsp90表达量的降低能够抑制贾第虫生长增殖及端粒酶的活性。综上所述,本研究利用酵母双杂交系统成功筛选出十二指肠贾第虫端粒酶RNA结合域TRBD的互作蛋白Hsp90,并通过双分子荧光技术、免疫共沉淀技术、GST-Pull down技术验证TRBD与Hsp90存在相互作用。同时利用免疫荧光技术观察TRBD与Hsp90在贾第虫中的分布情况,而后利用Duolink(?)PLA技术确定二者在贾第虫体内存在相互作用且共定位于贾第虫双核上。最后,利用贾第虫病毒载体介导的锤头状核酶抑制Hsp90的表达,试验结果表明Hsp90表达量的降低能抑制端粒酶活性及贾第虫生长增殖。本研究初步探索Hsp90对贾第虫端粒酶活性的影响,为深入研究贾第虫端粒酶调控机制奠定基础。