黄瓜Whirly转录因子对线粒体DNA数量的调控研究

作     者：袁高雅 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈劲枫

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：黄瓜 Whirly家族分析 CsWHY2基因 线粒体DNA数量 

摘      要：黄瓜线粒体表现为特殊的父系遗传模式,但其遗传机制尚不清楚。已有的研究表明植物雄配子中mtDNA数量与线粒体遗传方式直接相关,黄瓜线粒体父系遗传调控的关键为花粉生殖细胞内mtDNA的数量。拟南芥Whirly家族成员WHY2是植物细胞mtDNA数量调控的一个重要因子,并且Cs WHY2转录水平与黄瓜花粉mtDNA数量呈正相关,推测黄瓜中WHY2可能参与了 mtDNA的数量调控。因此,本文通过鉴定黄瓜中的Whirly家族成员,对其进行克隆和生物信息学分析,并分析其表达特性。并且通过黄瓜Cs WHY2基因在拟南芥上的异源表达,探究该基因对mtDNA数量的影响,加深对黄瓜线粒体遗传的认识。具体如下:1.黄瓜Whirly家族基因的鉴定与分析首先进行黄瓜全基因组Whirly家族基因的鉴定,获取其序列信息。再以华北型黄瓜‘9930’为试验材料,克隆黄瓜Whirly家族基因的cDNA全长,对其进行生物信息学分析,并利用亚细胞定位分析其在细胞中的表达位置,同时通过RT-qPCR技术分析黄瓜Whirly家族基因在黄瓜中的组织表达特异性。结果发现黄瓜中有两个Whirly家族成员Cs WHY1和CsWHY2,其编码的蛋白均含有Whirly家族的保守结构域,其中CsWHY1基因包含1个长度为831 bp的开放阅读框（ORF）,共编码276个氨基酸,分子质量为30.729×103,理论等电点pI值为9.00,Cs WHY2基因包含1个长度为726 bp的开放阅读框（ORF）,共编码241个氨基酸,分子质量为26.742×103,pI值为9.56,两者蛋白序列均存在跨膜区域,且属于亲水蛋白;氨基酸序列分析和进化树分析表明Whirly家族在单子叶和双子叶植物中高度同源,CsWHY1和CsWHY2分别与甜瓜CmWHY1和CmWHY2具有较高的同源性;亚细胞定位表明CsWHY1定位在洋葱表皮细胞的质体中,CsWHY2定位在烟草叶片细胞的线粒体中,表明Cs WHY1和Cs WHY2基因分别在细胞的叶绿体和线粒体中发挥作用;RT-qPCR分析表明Cs WHY1和CsWHY2基因均具有组织表达特异性,其中CsWHY1基因在3个黄瓜品种中均表现为叶片中表达量最高,根和茎中表达量较低,其中衰老叶片中的表达量显著高于成熟叶片。与Cs WHY1类似,Cs WHY2基因在叶片中表达量最高,显著高于其他组织,在茎中表达量最低。2.黄瓜CsWHY2基因对mtDNA数量调控作用的研究本试验构建了 Lat52-Cs WHY2表达载体,通过转化拟南芥,实现了在Lat52花粉特异性启动子下,CsWHY2基因在拟南芥上的异源表达,研究该基因对mtDNA数量的影响。利用潮霉素抗性筛选、PCR、GUS染色和半定量PCR对转基因材料进行鉴定,确定黄瓜Cs WHY2基因在拟南芥中成功转录,并通过DAPI染色、qPCR和ddPCR对转基因材料进行鉴定和分析。通过DAPI对其成熟时期花粉进行染色发现,L-CsWHY2的成熟花粉中存在点状的细胞器DNA信号。利用RT-qPCR分析L-CsWHY2叶片中拟南芥线粒体编码基因nad6、atp1、rps4、cox1在基因组DNA中的相对拷贝数,发现与拟南芥WT相比,nad6、atp1、rps4、cox1在基因组DNA的相对拷贝数均有不同程度的增高;利用cox1基因作参考,通过ddPCR测定在叶片中的mtDNA绝对拷贝数发现,材料L-CsWHY2叶片中的mtDNA拷贝数比野生型WT有所增高,与相对拷贝数的趋势相一致。另外,拟南芥线粒体编码基因nad6、atp1、rps4、cox1涉及到ATP代谢、呼吸链电子传递等功能,测定其在L-CsWHY2的叶片和花中的相对表达量,发现这4个基因的表达水平发生显著变化,atp1、rps4在L-CsWHY2的叶和花中的表达量均显著高于野生型WT;nad6在L-CsWHY2的叶和花中的表达量均显著低于野生型WT;cox1在L-CsWHY2的叶中表达量显著高于WT,在花中的表达量则显著降低。以上结果表明:黄瓜CsWHY2基因能够调控mtDNA的拷贝数,并能影响线粒体编码基因的表达,影响线粒体功能。