新型鹅星状病毒的分离鉴定及其对鸡和鸭的致病性研究

作     者：田茂泉 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刁有祥

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：新型鹅星状病毒 分离鉴定 鸡 鸭 致病性 

摘      要：近年来,关于禽星状病毒的报道越来越多,其在鸡、鸭和鹅等家禽中的感染已经非常普遍。2016年以来,主要引起雏鹅痛风的新型鹅星状病毒的爆发和迅速传播,给我国养鹅产业造成了巨大的经济损失。目前越来越多的研究证实,新型鹅星状病毒具备在家禽之间跨物种传播以及适应新宿主的潜能,被感染的新宿主表现出与雏鹅感染相似的症状。本研究从临床疑似患病样品中分离出9株新型鹅星状病毒,对分离毒株进行鉴定分析以确认新型鹅星状病毒的变异情况,并选取优势毒株进行了对SPF鸡和肉鸭的致病性研究,旨在为科学预防和控制新型鹅星状病毒的感染提供理论依据。1.新型鹅星状病毒的分离与鉴定对本实验室2021～2022年采集的部分疑似感染样品进行PCR检测,采用鸡胚肝细胞(CEL)对阳性样品进行病毒分离,共分离9株新型鹅星状病毒株,其中鸭源3株,鹅源6株。测序分析结果显示,9株分离毒株病毒核苷酸同源性在97.0%～99.8%之间,与经典毒株SDPY株核苷酸同源性在97.5%～99.1%之间,并在遗传进化树的同一分支上,表明分离毒株未发生明显变异。分离毒株与经典火鸡源、鸭源、鸡源星状病毒处于不同分支,亲缘关系较远。选取SDTZ2021株进行动物致病性研究与动物回归试验。1日龄健康雏鹅静脉注射0.3 m L(TCID=10/0.1 m L)病毒液后,雏鹅出现精神沉郁,卧地倦动、采食下降等临床症状,死亡雏鹅心脏、肝脏表面有尿酸盐附着、沉积,肾脏肿大、出血,输尿管、腺胃有尿酸盐沉积等病理变化。2.新型鹅星状病毒对SPF鸡的致病性研究将160只1日龄健康SPF鸡随机分为4组:口服感染组、颈部皮下组感染组、腿部肌内感染组和对照组,每组40只。各感染组1日龄每只接种0.6 m L(TCID=10/0.1m L)病毒液,对照组每只接种0.6 m L无菌生理盐水,观察各组SPF鸡的临床症状及剖检病变。于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、14 d、17 d、20 d、24 d、28 d、33 d、38 d、44 d每组随机抽取3只称重监测体重变化,采集泄殖腔棉拭子、非抗凝和抗凝血各3份,分别用于监测SPF鸡的排毒规律、病毒血症和血清抗体水平变化;收取心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、胸腺、腺胃、延脑、法氏囊和胰腺等组织器官用于病理组织切片制备、病毒组织分布及载量检测。结果显示,感染组SPF鸡在4 dpi出现精神不振、扎堆、嗜睡、排白色稀便症状;剖检可见肝脏、肾脏肿大出血,肾脏表面与输尿管内有少量的尿酸盐沉积,胸腺出血。感染组的体重均低于对照组且增长缓慢,以皮下感染组最为显著。病理组织学结果显示,各感染组SPF鸡表现心肌出血,心肌纤维断裂,间隙增宽;肝细胞坏死,有大量炎性细胞浸润;淋巴细胞大量崩解、坏死,脾髓细胞破坏并有大量红细胞分布;肾间质毛细血管充血,肾间质结构破坏,并伴有炎性细胞浸润;胸腺皮质、髓质出现大量红细胞。病毒组织分布及载量检测结果显示,新型鹅星状病毒具有广泛的组织嗜性,可分布于SPF鸡的各组织器官,各感染组病毒含量最高的器官均为肝脏。各感染组病毒血症与排毒规律变化基本一致,均在感染早期出现排毒,口服感染组和颈部皮下感染组于7 dpi达到高峰,肌内感染组于5 dpi达到高峰,之后一直呈现下降趋势。结合组织器官病毒载量、病毒血症和排毒规律,在人工感染SDTZ2021株病毒后,SPF鸡体内的病毒含量随感染日龄的增加呈现先升高后降低的趋势,于5～7 dpi达到最高。各感染组抗体水平呈现由高到低的变化趋势,与对照组差异极显著(P0.01)。3.新型鹅星状病毒对肉鸭的致病性研究本研究以不同感染日龄、感染方式进行实验设计:1日龄感染组标记为A,7日龄感染组标记为B,14日龄感染组标记为C;口服感染组标记为1,颈部皮下感染组标记为2,腿部肌内感染组标记为3。试验将400只1日龄健康雏鸭随机分为10组:A1,A2,A3,B1,B2,B3,C1,C2,C3和对照组,每组40只。感染组雏鸭每只接种SDTZ2021株病毒液0.6 m L(TCID=10/0.1m L),对照组每只接种0.6 m L无菌生理盐水,观察各组临床症状及剖检病变。体重的监测与样品的采集与SPF鸡致病性试验相同。结果显示,9个感染组在1 dpi即出现食欲不振,排白色粪便症状。感染组于2～4 dpi出现死亡,7～12 dpi达到死亡高峰,死亡率为5%～20%。结果显示,7日龄感染组(B组)和肌内感染组(3组)的死亡数最多,7日龄肌内感染组(B3组)肉鸭死亡率最高。各感染组剖检病变基本一致,表现为肝脏、肾脏肿大出血;输尿管中有尿酸盐沉积;脾脏肿大呈斑驳状;其中7日龄肌内感染组(B3组)病变最为严重,在心脏等内脏器官表面出现了白色尿酸盐沉积。感染组体重均低于对照组且增长缓慢,以肌内感染组(3组)最为显著。各感染组病理组织学变化基本一致,表现为:心肌纤维水肿,心肌纤维周围钙盐沉积;肝细胞肿胀坏死,肝细胞索紊乱;脾组织内淋巴细胞崩解、坏死,充满大量红细胞;肾小球毛细血管萎缩,部分毛细血管可见蓝染钙盐团块颗粒,间质严重充血,肾小管萎缩。病毒组织分布及载量检测结果显示,新型鹅星状病毒可分布于肉鸭的各组织器官,各感染组病毒含量最高的器官均为肾脏,7日龄肌内感染组(B3组)肉鸭各组织器官病毒含量最高。各感染组病毒血症与排毒规律的变化基本一致,均在感染早期出现排毒,且最高峰值出现在肌内感染组(3组)。各感染组抗体水平呈现由低到高的变化趋势,与对照组差异极显著(P0.01)。综上,在人工感染SDTZ2021株病毒后,感染组雏鸭体内的病毒含量随日龄的增加呈现先升高后降低再升高的趋势,除1日龄口服感染组(A1组)雏鸭于7 dpi达到高峰外,其余感染组均于5 dpi达到高峰,1日龄、7日龄、14日龄感染组分别于17 dpi、14 dpi和11 dpi达到第二个高峰,第二个高峰载量普遍低于第一个高峰期。