mitomiR-207对线粒体功能的调控及其在体表达对大鼠心力衰竭的影响

作     者：吕超凡 

作者单位：天津体育学院 

学位级别：硕士

导师姓名：赵云罡

授予年度：2022年

学科分类：0403[教育学-体育学] 040302[教育学-运动人体科学(可授教育学、理学、医学学位)] 04[教育学] 

主      题：mitomiR-207 线粒体电子传递链 线粒体功能 在体表达 心力衰竭 有氧运动 

摘      要：研究目的:本研究拟在前期工作基础上,探讨mitomi R-207对线粒体功能的调控机制,并观察其在有氧运动对大鼠心力衰竭干预中的作用。研究内容:(1)分别在细胞水平和实验动物水平验证mitomi R-207通过上调线粒体基因的表达以增强线粒体功能的作用,并将该作用与有氧运动延缓心力衰竭进程联系起来;(2)将分子变化回归到生理机制,定向过表达mitomi R-207于心力衰竭大鼠的心肌组织中,观察心力衰竭大鼠的生理学指标,完善mitomi R-207在有氧运动干预心力衰竭过程中增强心脏功能的分子途径,建立“有氧运动-mitomi R-线粒体功能-干预心衰的理论通路。研究方法:1.在细胞水平验证mitomi R-207对线粒体基因表达的调控:1)将预测的ND4、ND6和COX3三个靶基因的靶位点插入pmir GLO双荧光素酶报告基因的质粒中,再与过表达mitomi R-207的重组载体(pc DNA-mitomi R-207)共转染到HEK-293T细胞中,48小时后收集细胞,用pmir GLO双荧光素酶报告基因系统对预测的靶点进行验证。2)将过表达mitomi R-207质粒(pc DNAmitomi R-207)和阴性对照(pc DNA)转染到HEK-293T细胞14小时后,加入依米汀抑制细胞质蛋白翻译,培养4小时后收集细胞并破碎,进行Click化学点击实验后用SDS-PAGE进行分离,观察过表达mitomi R-207后线粒体编码蛋白的表达谱的变化,确认mitomi R-207的调控蛋白。2.在体实验验证mitomi R-207缓解心力衰竭的生理学效应以及对线粒体基因表达的调控:1)对Wistar大鼠进行主动脉缩窄手术与主动脉剥离手术,在安静饲养8周后,进行小动物超声成像系统检测确定心衰模型建立。将心衰大鼠随机分成4组,假手术组(SHAM);心衰对照组(C):不进行任何处理;AAV9对照组(AAV):仅尾静脉注射AAV9空病毒;mitomi R-207组(AAV-mi R-207):将包装了mitomi R-207的AAV9病毒以尾静脉注射的方式转染入大鼠体内。对4组大鼠安静饲养10周后进行心脏结构及功能检测。2)对心肌组织以Western Blot法测定细胞实验中确定的上调蛋白的表达情况。研究结果:(1)在细胞中过表达mitomi R-207进行双荧光素酶报告基因检测,与对照组相比,连入靶基因COX3、ND4和ND6的靶序列的荧光素酶活性显著降低。(2)在体外细胞实验中,过表达mitomi R-207后观察线粒体蛋白表达谱的变化,与对照组相比,线粒体编码蛋白COX3、ND4和ND6的表达显著提高。(3)在体心衰大鼠实验表明,心脏定向过表达mitomi R-207后,与空载体组相比,心脏的射血分数、缩短分数、左心室与体重的比值、左心室舒张末期及收缩末期前壁厚度、左心室舒张末期及收缩末期后壁厚度均显著升高,左心室舒张末期及收缩末期容积、左心室舒张末期及收缩末期内径显著降低。与空载体组相比,mitomi R-207组的体重没有显著性差异。(4)在体心衰大鼠心脏定向过表达mitomi R-207后,与空载体组相比,线粒体编码蛋白ND4的表达显著提高。研究结论:(1)mitomi R-207转位入线粒体后,其主要的靶位点位于COX3、ND4和ND6上,并上调了这三个亚基的表达,从而增强了ETC活力,尤其是复合体I的活力。(2)在心衰大鼠心脏定向过表达mitomi R-207可以增强线粒体编码蛋白ND4的表达,改善心脏结构与功能的重塑,最终缓解心力衰竭。