miR-199a-3p靶向调控MMP16/collagenⅠ通路在大鼠心房颤动中的作用研究

作     者：杨成业 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：钟国强

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：心房颤动 miR-199a-3p MMP16 

摘      要：心房颤动(房颤)是一种较为常见的心律失常,患者有心力衰竭、缺血性脑卒中等并发症,甚至死亡。房颤的病因复杂,确切机制尚不清楚,学界普遍认为主要包括心房肌电重构、结构重构。结构重构包括细胞凋亡、心肌成纤维细胞增生、细胞外基质过度沉积形成纤维化等改变。心房纤维化是房颤发生、维持的重要因素。MicroRNA(miRNA)是一种长度约为22个核苷酸的非编码RNA,可降解mRNA或抑制mRNA编码的蛋白质翻译,调节靶基因表达。基质金属蛋白酶(MMP)在降解细胞外基质(ECM)中蛋白质成分发挥重要作用,其中包括主要的纤维化成分Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)等。若MMP的降解能力低于ECM的生成,则ECM降解减少,导致ECM的过度沉积,引起组织纤维化。因此,我们假设miR-199a-3p可能通过调节MMP16的表达调控心房纤维化,影响房颤的发生和维持。本研究旨在探讨miR-199a-3p在大鼠房颤中的作用及其机制。实验分三个部分,第一部分建立大鼠房颤模型,探讨miR-199a-3p与胶原容积分数(CVF)是否相关。第二部分利用生物信息学数据库Target Scan寻找miR-199a-3p的潜在靶基因。第三部分构建腺相关病毒转染大鼠,通过干预大鼠心房的miR-199a-3p的表达量,验证MMP16是否为miR-199a-3p的靶基因。第一部分MiR-199a-3p在大鼠心房颤动模型中的作用研究目的和意义:初步探讨miR-199a-3p在大鼠房颤发生及发展中的作用方法:经尾静脉注射CaCl2-Ach复合物建造SD大鼠房颤模型,分为窦律(SR)组与房颤(AF)两组。使用实时荧光定量聚合酶链式反应技术(RT-qPCR)分别检测两组大鼠心房的miR-199a-3p表达量,RT-qPCR检测两组大鼠心房collagenⅠ的mRNA表达量,masson染色检测两组大鼠心房CVF,免疫印记(WB)检测两组大鼠collagenⅠ蛋白表达量。结果:AF组的miR-199a-3p(2.11±0.44)、CVF(14.09±0.65)均高于SR组的miR-199a-3p(1.00±0.19)(p0.05)。两组的心房标本的miR-199a-3p表达水平均与CVF呈正相关(r=0.78 p0.05)。结论:miR-199a-3p在房颤的发生及维持中发挥作用,机制可能是通过促进心房纤维化引发房颤。第二部分通过生物信息学软件预测MMP16为miR-199a-3p的潜在靶基因目的和意义:预测miR-199a-3p的靶基因及结合位点方法:利用Target Scan生物信息学网站检测miR-199a-3p的靶基因及结合位点。结果:Target Scan网站预测结果显示,MMP16-3’UTR区有1个与miR-199a-3p结合的位点。结论:MMP16可能为miR-199a-3p的靶基因第三部分miR-199a-3p靶向调控MMP16/collagenⅠ通路在大鼠心房纤维化中的作用研究目的和意义:通过构建和应用miR-199a-3p低表达及过表达腺相关病毒转染SD大鼠,探讨miR-199a-3p大鼠房颤模型中对MMP16、collagenⅠ的影响。方法:第一节构建miR-199a-3p低表达及过表达基因,并且以腺相关病毒作为载体,整合进入病毒基因序列。将已经构建好的病毒载体转染至AAV-293细胞(病毒包装),纯化病毒并检测病毒的滴度。第二节,将30只雄性SD大鼠按照不同处理方式随机分为3组:(1)阴性对照(NC)组(n=10):经尾静脉注射阴性对照腺相关病毒(HBAAV2/9-TNT-GFP NC对照,剂量为200 u L/只),之后常规饲养,2周后予以CaCl-Ach复合液尾静脉注射;(2)miRNA-199a-3p低表达组(n=10):经尾静脉注射miR-199a-3p低表达腺相关病毒(HBAAV2/9-MiR30-rno-miR-199a-3p-GFP,剂量为200 u L/只),之后常规饲养,2周后予以CaCl-Ach复合液尾静脉注射;(3)miRNA-199a-3p过表达组(n=10):经尾静脉注射miR-199a-3p过表达腺相关病毒(HBAAV2/9-TNT-rno-miR-199a-GFP,剂量为200 u L/只),之后常规饲养,2周后予以CaCl-Ach复合液尾静脉注射。RT-qPCR检测三组大鼠miR-199a-3p的表达量,MMP16及collagenⅠ的mRNA的表达量,使用masson染色检测三组大鼠心房CVF,W