基于RNA-seq技术分析CA/ROSC后脑损伤转录组学特征及乌司他丁干预效果
作者单位：安徽医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：张泓
授予年度：2022年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学]
摘 要：1背景和目的心搏骤停(Cardiac arrest,CA)常见且致命,CA后脑损伤是CA/自主循环恢复(Return of spontaneous circulation,ROSC)后综合征的主要病理生理变化之一。目前临床尚缺乏确定疗效的药物及技术,该问题不仅困扰医务工作者,更增加社会及家庭负担。已成为急危重症基础和临床研究领域的重点和难点,极有必要寻求新的干预手段且深入探索其作用机理。而CA/ROSC后脑损伤的机制及病理生理还没充分明确,既往研究针对几个生物标志物或某条机制通路的几个因子,难以整体全面地诠释确切作用机制,同时,研究结果的异质性较大,对临床指导意义不大。乌司他丁(Ulinastatin,UTI)对许多种类的蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制的功能,还具有抑制炎症反应、凋亡反应以及清除自由基等的功能,在临床上较为普遍地应用于脓毒症、重症急性胰腺炎及多器官功能障碍治疗。有研究表明UTI可以通过抗氧化和抗炎反应多种类型的脑损伤产生脑保护作用。RNA测序(RNA-sequencing,RNA-seq)是以二代高通量测序技术为基石,可研究某个物种或特定组织转录组,通过转录组分析实现整体水平研究基因结构及功能,进而揭示疾病发展过程及对应生物学过程中的分子机制,是研究基础生物学以及疾病机理必用的技术方法之一。本研究使用RNA-seq技术筛选显著差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),希冀探索CA/ROSC后脑损伤病理生理机制以及UTI的干预效果。经文献检索尚未见到相关研究报道,故研究具有创新意义和一定临床借鉴价值。2方法实验将111只SD大鼠随机分为对照组(n=9)、假手术组(n=28)、模型组(n=46)和UTI组(n=28)。模型组建立CA/ROSC模型;UTI组在建立CA/ROSC模型基础上,于CPR成功后2min采用静脉注射UTI(100000 U/kg)干预;假手术组进行除CA/CPR以外的其他操作,对照组不做任何处理。观察比较各组大鼠2周生存率。使用湿干重比法及HE染色法来研究观察各组大鼠术后1d、3d和7d的病理学特点。采用Aim Plex流式高通量多因子检测技术检测各组大鼠血清内IL-6及TNF-α水平。于术后1d和3d分别提取各组大鼠左半侧大脑进行RNA测序。然后根据RNA-seq结果中显著DEGs进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的功能和通路富集分析,进而分析总结CA/ROSC后脑损伤病理生理机制以及UTI的干预效果和机制。选定CCL-2及Plg等显著DEGs,进一步采用蛋白印迹(Western Blot,WB)和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)技术进行基因验证。3结果各组大鼠基础参数值无明显差异。UTI组CA/ROSC大鼠总体存活率显著高于模型组(50%vs 30%)。假手术组大鼠2周存活率为100%。模型组大鼠造模后1d、3d、6d、10d、14d存活率分别为70%(7/10)、50%(5/10)、50%(5/10)、30%(3/10)、30%(3/10)。UTI组大鼠1d、3d、6d、10d、14d的存活率分别为80%(8/10)、60%(6/10)、60%(6/10)、50%(5/10)、50%(5/10)。与假手术组相比,模型组大鼠脑组织含水量第1d、3d及7d呈先逐渐增加、后轻微减轻的趋势。HE染色结果显示,CA/ROSC后第3d大鼠脑损伤情况最严重,神经细胞大量胞体空泡样变性,细胞间隙增大。Aim Plex流式高通量多因子检测技术结果表明,模型组3d血清IL-6、TNF-α水平明显升高,UTI组能明显降低血清中IL-6(5.9267±1.21138 vs 1204.8567±372.76861,P0.01)和TNF-α(2.3267±0.64933 vs 8.5533±1.98953,P0.05)炎症因子含量。GO和KEGG富集分析显示,DEGs主要富集在IL-17信号通路及神经活性配体-受体相互作用机制通路。CA/ROSC后脑损伤发生1～3d期间,IL-17信号通路持续表达上调,神经活性配体-受体相互作用通路持续表达下调;UTI干预后IL-17信号、Toll样受体信号等免疫机制通路及甲型流感、麻疹等感染性疾病机制通路显著下调,神经活性配体-受体相互作用通路显著上调。WB验证结果显示,模型组(3d)CCl2蛋白表达增加,UTI处理后CCl2蛋白表达减少(P0.05);Plg蛋白表达在造模3d后降低,UTI治疗后显著升高(P0.05)。IHC实验结果发现Plg表达呈一致性趋势。此外,IH
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