EGFR跨膜结构域二聚化位点对ERBB家族磷酸化影响的机制研究

作     者：乔森楠 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙非

授予年度：2022年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 100701[医学-药物化学] 

主      题：表皮生长因子受体 跨膜结构域 磷酸化位点 dSTORM成像 抗肿瘤靶点 

摘      要：EGFR作为第一个被发现的受体酪氨酸激酶,在生物体中,主要负责调节细胞增殖、存活以及分化。同时作为最经典的药物靶点,EGFR代表着一个靶向治疗的时代,EGFR靶向药物深刻地改变了肿瘤的治疗方式,给患者带来了极大的益处。目前,虽然关于EGFR相关信号通路及作用机制的研究已经较为成熟,针对EGFR及其突变研究开发的靶向药物也在癌症的临床治疗中得到了广泛的应用,并且已经有抗体和小分子化合物等多种类型的EGFR抑制剂在临床中被应用,但是EGFR仍然是炙手可热的研究热点。尤其是目前针对EGFR抑制剂的研发主要集中在胞外结构域和激酶结构域,但是这些结构域容易发生耐药突变,从而影响治疗效果,甚至使EGFR靶向药物对患者完全失去作用。目前针对EGFR跨膜结构域的相关研究并不完善,作为一种跨膜蛋白,EGFR的跨膜结构域呈α螺旋结构,主要由疏水氨基酸组成,跨膜结构域可以将EGFR锚定在细胞膜上,还可以与其它蛋白的跨膜结构域相互作用,因此该结构域是影响EGFR相关生物功能的关键结构。EGFR跨膜结构域对EGFR二聚体的形成和下游信号通路的磷酸化和激活都具有不可忽视的作用,并且该区域相对保守,不易产生突变,因此是非常理想的抗肿瘤药物新靶点。本论文在实验室前期分子动力学模拟结果的基础上从理论上分析出了EGFR跨膜结构域二聚结合的关键氨基酸残基,进一步从实验角度分析这些位点是否是影响EGFR跨膜结构域结合和功能的关键位点,以及这些位点是否具备成为EGFR靶向药物新靶点的潜力。本论文首先基于CRISPR/Cas9技术构建了2株EGFR突变型人结肠癌SW480稳转细胞株,根据设计分别命名为SW480和SW480。然后通过细胞增殖实验、药物敏感性实验、流式凋亡检测对EGFR跨膜结构域关键氨基酸位点突变可能对细胞生物学功能产生的影响进行分析。最后利用dSTORM超分辨细胞成像实验、磷酸化抗体芯片检测和生物信息学实验对EGFR跨膜结构域关键氨基酸位点突变可能对细胞表面EGFR的聚集状态、ERBB家族磷酸化情况和信号通路产生的差异进行分析。实验主要研究结果如下:(1)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了2株EGFR突变型纯合子SW480稳转细胞株。(2)EGFR跨膜结构域上Leu665、Phe666和Met667氨基酸位点突变对人结肠癌SW480细胞的增殖、药物敏感性和凋亡均产生了显著的影响,在细胞增殖检测结果中,SW480增殖能力明显低于其它两种细胞;EGFR经典二聚化抑制剂如厄洛替尼、吉非替尼等对SW480的敏感性要更强一些;细胞凋亡检测结果中,SW480与SW480未发现明显差异,SW480在早期凋亡细胞群和晚期凋亡细胞群产生了显著差异,早期凋亡细胞群占比由SW480组2.84%增加为4.93%,晚期凋亡细胞群由SW480组2.85%增加为7.81%,同时损伤细胞群的占比也明显偏高。(3)为了进一步研究二聚化和ERBB家族磷酸化,本论文通过细胞dSTORM超分辨细胞成像,实验结果显示Leu665、Phe666和Met667氨基酸位点是EGFR二聚过程中关键的结合位点,在rh EGF刺激后,SW480细胞表面的EGFR并没有发生明显聚集,且相对分散,与SW480和SW480细胞差异较明显。理论上,突变影响二聚化后会进一步影响ERBB家族的磷酸化。EGFR磷酸化抗体芯片检测数据验证了这种推测,实验结果显示EGFR跨膜结构域关键氨基酸位点突变后,SW480组在rh EGF刺激后,p EGFR(Tyr992)等十个磷酸化蛋白的磷酸化程度保持不变甚至下降,尤其是p EGFR(Ser1046/1047)、p EGFR(Ser1070)、p EGFR(Tyr1173)和p ERBB2(Tyr1248)这些药物研发的关键磷酸化位点,SW480对这些磷酸化位点的抑制体现了它成为抗肿瘤新靶点的潜力。(4)在生物信息学分析中,ERBB和PI3K信号通路受到了明显的调控,SW480组中有更多的磷酸化蛋白参与到信号传导的过程中,SW480组中磷酸化则受到了一定的抑制。SW480在理论上是增强EGFR二聚化的突变,实验结果与理论预测基本一致,该突变促进了细胞的增殖,对EGFR二聚化抑制剂敏感性降低,EGFR在细胞膜表面成簇密度更大,更易发生聚集,相关的磷酸化位点与野生型相比磷酸化程度更强。而SW480在理论上是抑制EGFR二聚化的突变,该突变在细胞生物学功能、EGFR在细胞膜表面聚集状态和相关磷酸化位点的激活方面都受到了一定抑制,但对药物的敏感性更强。综上所述,EGFR跨膜结构域α螺旋的Leu665、Phe666和Met667氨基酸位点是二聚过程中关键的结合位点,而且这些位点的突变严重影响了ERBB家族的磷酸化水平及与之相关的及细胞增殖、凋亡、药物敏感性。这些结果不仅更有说服力地证明了EGFR跨膜结构域二聚化的结合形式,而且通过对ERBB家族磷酸化影响的研究,为抗肿瘤药物提供了一个具有极大潜力的新靶点。