牛轮状病毒HB01株的分离鉴定及VP7亚单位疫苗初步研究

作     者：金宇航 

作者单位：河北科技师范学院 

学位级别：硕士

导师姓名：芮萍;刘奇

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牛轮状病毒 分离鉴定 遗传进化分析 真核表达 亚单位疫苗 

摘      要：牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)属于呼肠孤病毒科,轮状病毒属,是分节段的双链RNA病毒,为A群轮状病毒(Rotavirus,RV),是引起犊牛腹泻的重要病原之一。BRV最易感染7日龄内的犊牛,发病率约90%～100%,病死率达到50%;对于成年牛大多为隐性感染,会向外界持续排毒,对全世界养牛业造成了重大的经济损失。RV的11个基因片段易发生基因重配,重配毒株的出现使得防控更加困难。因此,了解BRV的变异规律有利于疫苗的研发和疫病的防控。本试验从河北省某牛场犊牛腹泻病料中分离鉴定出一株BRV,进行全基因组扩增和测序,并对VP7和VP4基因序列进行遗传进化分析。构建了BRV VP7真核表达质粒,表达纯化获得VP7蛋白并制备VP7亚单位疫苗,通过免疫BALB/c小鼠进行免疫原性测定,为BRV的防控提供参考依据。***的分离鉴定及遗传进化分析本研究对RT-PCR检测为阳性的河北省某牛场犊牛腹泻粪便样品,在MA-104细胞中连续盲传5代后出现细胞病变,分离获得一株BRV,通过PCR与间接免疫荧光技术鉴定后命名为RVA/Cow-wt/HB01/China/2021/G6P[1](简称为HB01),通过全基因组扩增后进行基因序列测序分析,分析得出其完整血清型为G6-P[1]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T6-E2-H3。通过对HB01株VP7和VP4基因进行遗传进化分析发现,该分离毒株与经典毒株NCDV株VP7和VP4基因同源性最高,分别处于同一分支。研究结果为BRV的遗传进化和疫苗研发提供参考。*** VP7蛋白真核表达纯化及亚单位疫苗免疫动物水平研究本研究对BRV VP7基因进行密码子优化,构建了pCAGGS-BRV-VP7真核表达质粒,借助HEK-293F真核细胞表达系统表达VP7蛋白,将表达的蛋白经过蛋白亲和层析和凝胶层析纯化后获得纯度较高的VP7蛋白。将真核表达BRV VP7蛋白免疫BALB/c小鼠,进行亚单位疫苗的免疫原性研究。结果显示通过流式细胞分选技术检测免疫小鼠脾脏脾淋巴细胞CD4、CD3亚型淋巴细胞比例增加;MTT法检测试验组脾淋巴细胞增殖率上升;试验组小鼠血清中IFN-γ、IL-4细胞因子含量上升;试验组小鼠血清中BRV中和抗体的滴度为1∶46。研究结果为BRV VP7亚单位疫苗的研制提供参考。