睾丸特异性lncRNA在精子发生中的作用研究

作     者：熊素萍 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾旭辉;罗韬;张小宁

授予年度：2021年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：精子发生 lncRNA 不育 生殖毒性 雷公藤甲素 

摘      要：研究背景:长链非编码RNA（long non coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200 nt的调控性RNA。lncRNA在各种生命活动的调节与疾病的发生发展中起着重要作用。然而,lncRNA是否参与哺乳动物精子发生尚不清楚。精子发生是一个受到精密调控、最终产生成熟精子的生物学过程,但其机制远未阐明。因此,本研究以通过高通量测序和生物信息学分析筛选出的2个睾丸特异性lncRNA lnc240（NONCODE ID:NONMMUT049240.2）,Gm31453及其潜在编码基因Cpa5（carboxypeptidase A5,Cpa5）为目标,利用基因敲除（Knock Out,KO）小鼠,在正常生理和不育造模药物胁迫条件下研究lncRNA在精子发生中的作用及机制,以期为探究lncRNA的功能和理解精子发生的调控机制提供新视角。研究方法:流式细胞术分选不同阶段生精细胞,研究目标基因表达情况。Crispr/Cas9技术构建lnc240,Gm31453和Cpa5的KO小鼠,研究KO小鼠精子发生情况及生育能力。HE（hematoxylin-eosin staining）染色分析睾丸和附睾发育情况。计算机辅助精子分析系统对精子形态与运动参数进行检测。高通量测序结合生物信息学分析研究雷公藤甲素胁迫后lncRNA在精子发生的作用。q PCR研究KO小鼠中目标基因及其潜在靶基因的表达。研究结果:lnc240、Gm31453及其可能通过Cis方式靶向调控的编码基因Cpa5均呈现睾丸特异性表达,主要表达于次级精母细胞、圆形及长形精子。三种KO小鼠与野生型小鼠相比,其睾丸与附睾发育、精子浓度与活力、生育能力均未见显著差异。由于Gm31453是STRBP的互作分子,且可能靶向调控Cpa5的表达,我们分析了Gm31453对STRBP和Cpa5表达的影响。结果显示,Gm31453缺失导致Cpa5表达下调,STRBP表达上调。鉴于在正常生理条件下lncRNA的缺失无明显生殖表型,我们在不利胁迫造成的畸少弱精小鼠模型中继续探讨了lncRNA对精子发生的影响。小鼠灌胃给药雷公藤甲素35天后,睾丸发育明显异常,附睾中出现畸形精子且精子数量显著减少。高通量测序发现大量lncRNA表达发生异常。差异表达m RNA和lncRNA靶基因的GO和KEGG功能富集分析发现,多种与精子发生相关的生物学过程和信号通路受到显著影响。然而Gm31453 KO小鼠在同等剂量雷公藤甲素处理下导致的生殖毒性作用显著减弱。结论:lnc240,Gm31453和Cpa5单独缺失不影响精子发生与小鼠生育能力;在分子层面,lncRNA对于相关靶基因的表达起到微调作用;不利胁迫下,lncRNA缺失对精子发生可能具有一定的保护作用。