白花地胆草单体EM-2通过活性氧介导PI3K/Akt信号通路并诱导结肠癌细胞发生凋亡

作     者：林威达 

作者单位：暨南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹明溶;蒋建伟

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：白花地胆草 PI3K/AKT信号通路 活性氧 细胞凋亡 细胞自噬 

摘      要：目的:本研究探讨白花地胆草单体EM-2诱导人结肠癌细胞凋亡的作用及其作用机制,为白花地胆草单体EM-2将来应用于临床提供实验依据。方法:采用MTT法和细胞克隆形成检测EM-2对人结肠癌细胞活性及增殖的影响;EM-2处理SW620细胞后,流式细胞术检测细胞中活性氧水平变化和细胞凋亡率;免疫印迹法检测细胞自噬与细胞凋亡相关蛋白水平;ROS清除剂（NAC）预处理对EM-2诱导的人结肠癌细胞凋亡的影响以及相关信号通路的检测;免疫荧光法检测细胞自噬相关蛋白的变化。结果:MTT检测结果显示,EM-2能够剂量依赖性抑制人结肠癌细胞的活性,且对正常人上皮细胞LO2和293T的毒性较小;同时,克隆形成实验证明了EM-2对结肠癌细胞的增殖具有抑制作用。接下来,通过流式细胞术检测,结果显示,在SW620细胞中,EM-2处理能够显著诱导细胞凋亡并呈剂量依赖性;与此相一致的是,免疫印迹法检测显示,EM-2能够剂量依赖性下调凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）并且上调活化的Caspase-3/9以及活化的PARP。进一步通过DCFH-DA探针检测发现,EM-2处理能够提高细胞内ROS的水平;NAC预处理能够降低EM-2导致的ROS水平升高并且抑制EM-2诱导细胞凋亡的作用,表明EM-2可能通过提高细胞内ROS的产生导致线粒体破化而诱导细胞凋亡。机制研究显示,EM-2处理后能够降低AKT和m TOR的磷酸化水平,同时抑制了PI3K、AKT以及m-TOR总蛋白的表达。相反,NAC预处理逆转了EM-2对AKT和m TOR磷酸化的抑制作用,从而下调了Bik以及上调了Bcl-xl,Mcl-1的表达,进一步抑制了Caspase-3/9以及PARP的活化,最终逆转了EM-2诱导的细胞凋亡,说明EM-2可能通过调节PI3K/AKT-m TOR途径诱导细胞凋亡。另一方面,本研究发现,EM-2能够促进LC3B和p62蛋白的表达并且抑制beclin1的表达;与此相一致的是,免疫荧光检测同样显示LC3B和p62表达上升。同时,我们发现EM-2明显抑制溶酶体相关膜蛋白2的表达,并且线粒体外膜受体Tom20表达显著上升。说明EM-2能够使溶酶体功能受损,并抑制细胞线粒体自噬的发生。结论:***-2能够降低人结肠癌细胞的活性并抑制其增殖。***-2通过上调ROS水平破坏线粒体诱导细胞凋亡。***-2可能通过调控PI3K/AKT-m TOR途径发挥抗肿瘤作用。***-2能够破坏溶酶体并阻断细胞自噬的发生。综上所述,白花地胆草单体EM-2能够诱导人结肠癌细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用,其机制可能是通过破坏溶酶体并阻断细胞线粒体自噬的发生,从而诱导ROS上升,抑制PI3K/AKT-m TOR途径,导致线粒体破坏,进而诱导细胞凋亡。这些结果说明白花地胆草单体EM-2具有一定的抗肿瘤活性以及潜在的临床应用价值。