Junctophilin 2对肥厚心肌中小电导钙激活钾通道表达的调控

作     者：徐梦茹 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：樊红琨

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：心肌肥厚 JP2 SK2 H9c2细胞 主动脉缩窄 

摘      要：背景和目的目前,心血管疾病仍高居我国居民死亡率首位。多种心脏疾病均可并发心肌肥厚(cardiac hypertrophy),如心脏瓣膜病、高血压和扩张型心肌病等。心肌肥厚是心脏在压力或容量超负荷的情况下对心肌收缩力和心脏功能的一种适应性反应。持续性负荷会引起心室肌发生结构重构、离子通道重构(电重构)以及Ca重构,其中离子通道重构是病理性心肌肥厚并发恶性心律失常和猝死的重要因素。因此,揭示心肌肥厚电重构的分子机制,探讨各分子之间的相互作用,有效延缓或逆转心肌肥厚的病理过程可降低这些心血管不良事件的发生,具有重要的学术价值和科学意义。小电导钙激活钾通道(small conductance calcium-activated potassium channel,SK,Kca2)是非电压依赖性,由Ca激活的K通道,在可兴奋组织中广泛表达。正常生理情况下,主要表达在心房肌的SK2通道参与动作电位复极化末期的形成,很少在心室肌表达。但在心肌肥厚,心力衰竭和心肌梗塞等病理条件下,心室肌SK2表达显著增多,且功能增强。我们已经报道生理情况下心肌SK通道与膜耦联复合体蛋白Junctophilin 2(JP2)之间有相互作用,并且可以通过JP2 MORN结构域调控SK2通道的功能和转运。表达在心肌细胞的JP2通过耦联肌质网(sarcoplasmic reticulum,SR)与T-管膜,实现细胞膜离子通道与SR钙离子的交通,提高心肌兴奋性,易化兴奋-收缩耦联。压力超负荷心肌肥厚动物模型,肥厚性心肌病及心衰的患者心肌JP2表达降低,有序的T-管结构破坏,Ca瞬变幅值降低,兴奋-收缩耦联减弱。因此,在心肌肥厚等病理情况下,SK2通道和JP2蛋白均可发生重构,JP2蛋白是否对病理情况下SK2通道的表达有调控作用,目前并未见报道。本实验拟采用血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)建立H9c2肥大心肌细胞模型,以及横向主动脉缩窄法(transverse aortic constriction,TAC)建立心肌肥厚小鼠模型;在体内外观察心肌SK2通道和JP2蛋白的表达;并靶向性敲减或过表达心肌细胞JP2蛋白,探讨肥厚心肌中JP2对SK2通道蛋白表达的影响。从理论上阐述心肌肥厚SK2通道表达改变的分子机制,为深入研究病理性心肌肥厚的发生发展机制和防治策略提供重要的实验依据。方法1.检测H9c2肥大心肌细胞模型JP2和SK2通道蛋白的表达用不同浓度Ang II诱导12 h,24 h,48 h和72 h制备H9c2肥大心肌细胞模型,通过Image-Pro Plus 6测算细胞面积以及Western blot方法检测脑利钠肽(natriuretic epeptide,BNP)蛋白表达,检验模型制备成功的Ang II浓度和时间。用Western blot检测Ang II诱导的H9c2肥大心肌细胞SK2通道和JP2蛋白的表达水平。2.探索JP2对H9c2肥大心肌细胞SK2通道m RNA和蛋白表达的影响Western blot和RT-q PCR方法检测敲减和过表达JP2对H9c2肥大心肌细胞SK2蛋白和m RNA表达水平的影响。H9c2细胞分为6组:Control组(正常H9c2心肌细胞);AngⅡ组(AngⅡ诱导的H9c2肥大心肌细胞);AngⅡ+Ad-NC-si JP2组(携带无关基因的敲减腺病毒感染H9c2肥大心肌细胞);AngⅡ+Ad-NC-JP2OE组(携带无关基因的过表达腺病毒感染H9c2肥大心肌细胞);AngⅡ+Ad-si JP2组(敲减JP2表达的腺病毒感染H9c2肥大心肌细胞);AngⅡ+Ad-JP2OE组(JP2过表达腺病毒载体感染H9c2肥大心肌细胞)。3.检测TAC术后压力超负荷心肌肥厚小鼠模型JP2和SK2表达变化C57BL小鼠通过TAC法构建压力超负荷心肌肥厚小鼠模型,术后4 w利用超声心动图、HE和Masson组织化学染色方法检测TAC术后各组小鼠的心脏功能、结构和心肌组织结构变化;Western blot检测主动脉缩窄对小鼠心肌组织SK2和JP2蛋白表达水平的影响。4.探索JP2对心肌肥厚小鼠模型心脏结构、功能及SK2通道表达的影响主动脉缩窄术后2 w小鼠尾静脉注射AAV9介导的JP2过表达载体(AAV9-JP2OE)或阴性对照病毒(AAV9-con),术后4 w超声心动图、HE和Masson染色观察注射病毒后心肌肥厚小鼠心脏结构和功能的变化;Western blot检测心肌组织JP2和SK2蛋白表达的水平。结果1.H9c2肥大心肌细胞模型JP2蛋白表达减少,SK2通道蛋白表达增加测算细胞面积可知,用10,10,10mol/L浓度AngⅡ处理的H9c2细胞面积均明显增加,但10mol/L AngⅡ诱导48 h作用最显著