水稻穗尖伸长突变基因8358的克隆及窄叶突变体8316的遗传鉴定

作     者：吴应海 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王平荣

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：水稻 穗尖伸长突变体 穗发育 窄叶突变体 基因克隆 

摘      要：1.水稻穗尖伸长突变基因8358的克隆稻穗发育影响穗粒数和粒重等性状,是决定水稻产量重要因素。通过对穗发育突变体的研究和基因克隆,为进一步了解水稻产量遗传调控网络提供基础。本研究通过对籼稻恢复系188R化学诱变,获得了一份遗传稳定的穗尖伸长突变体8358,对该突变体进行了遗传分析、基因定位和克隆及相关研究,主要研究结果如下:(1)表型观察及农艺性状分析:8358与野生型188R相对比抽穗期表现型为穗顶端枝梗伸长,顶端枝梗出现扭曲情况,并且顶端枝梗上着生的小穗减少。通过农艺性状调查,突变体有效穗、结实率、千粒重、株高分别减少了10.5%、1.4%、13.4%、11.2%;穗长及一次枝梗数分别增加了7.0%、4.1%,二次枝梗数在统计学上没有明显的变化。(2)幼穗形态观察及电镜扫描:对野生型与突变体幼穗观察,突变体8358穗尖较野生型明显伸长。选择相同发育时期的幼穗电镜扫描显示突变体的穂尖的一次枝梗明显伸长。(3)遗传分析及基因定位:通过构建遗传分析群体并统计调查,经过遗传分析及卡方检验8358突变性状受一对隐性核基因控制,利用SSR引物和In Del引物将候选基因初步定位在水稻第4染色体长臂上X1和RM303之间,遗传距离分别为7.4 c M和10.6 c M;之后将候选基因精细定位于In Del引物X2与X3之间,物理距离为280kb,与候选基因遗传距离分别为2.2c M与0.6c M。(4)候选基因的筛选、验证:结合高通量测序结果,对定位区间有突变位点的候选基因测序验证,发现该区间一个基因阅读框碱基104位由G突变为A,造成氨基酸35位由半胱氨酸C突变酪氨酸Y。因此,将该基因作为8358突变体的候选基因,暂命名为8358。(5)转基因功能互补验证及基因敲除验证:为了验证候选基因的功能,构建超表达载体p C2300-actin-8358,并利用农杆菌介导法转入突变植株中,获得的阳性转基因植株的穗子均表现野生型表型;同时以日本晴作为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术对候选基因进行定点敲除,发现敲除植株中阳性植株表现为穂尖伸长的突变表型。(6)组织表达分析:选取了野生型孕穗期的根、叶鞘、茎、叶、幼穗进行半定量RT-PCR分析结果显示8358基因主要在水稻幼穗中表达,而在根中几乎没有表达。同时,对水稻发育不同时期的不同组织进行实时荧光定量分析,结果显示8358基因在所有组织中均有表达,在孕穗期的幼穗表达量较高,在苗期和分蘖期根中表达量较低。2.水稻窄叶突变体8316的遗传分析及基因定位水稻叶片作为植物光合作用的重要器官,是绿色植物的光合产物生产部位,在植物“源、流、库、中起到“源的作用,对粮食作物的最终产量具有决定性的作用。本研究通过化学诱变籼稻恢复系188R,获得了一份遗传稳定的窄叶突变体8316,对突变体进行了农艺性状观察统计、遗传分析和候选基因初步定位,主要研究结果如下:(1)表型观察及农艺性状分析:8316突变体与野生型相比,水稻分蘖期叶片明显变窄,变直;株高变矮,籽粒变细长,结实率及千粒重明显的下降,但有效穗数增多。(2)遗传分析及基因定位:利用突变体与野生型亲本188R杂交,F代表现为正常植株,F代正常株与突变株分离比例为3:1,表明8316突变性状受一对隐性核基因控制。将8316与日本晴杂交构建的F代作为定位群体,最终将候选基因定位于引物H及H之间,遗传距离分别为1.74c M和2.32c M,物理距离为738kb。