串联抗Fc纳米抗体定向偶联免疫亲和柱的制备及性能评估

作     者：黄云祥 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：付金衡;涂追

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：小鼠IgG 串联纳米抗体 Halotag 定向偶联 

摘      要：纳米抗体是羊驼体内一类天然缺失轻链的重链抗体可变区,它是迄今为止发现的一种天然的可识别抗原结合域的最小单体,因其较高稳定性、分子量小、可重折叠,纳米抗体如今发展并应用于治疗、诊断、检测、生物成像以及免疫分析,而纳米抗体应用于亲和层析成为了新的方向。对于亲和层析分析,填料和材料的吸附载量是极其重要的指标,高的吸附载量有利于降低工业成本和减少下游纯化蛋白的时间,尤其是在工厂中的应用中,增加填料吸附载量的关键因素在于改善识别配基生物活性分子的密度。本论文通过串联抗小鼠IgG Fc端纳米抗体,从而提高生物活性分子的密度,改善了填料的吸附载量,研究意义重大,本研究的主要内容如下:1.通过基因工程原理与技术,将抗小鼠IgG Fc端的纳米抗体AFV通过刚性Linker R（MAQPA）与AFV结合,构建了与Halotag融合表达的载体pET30a-H-AFV,pET30a-H-diAFV,pET30a-H-triAFV 和 pET30a-H-tetAFV,经过菌落 PCR 验证,将其送至基因测序公司测序,经过与原有序列比对表明AFV正确插入预定的位置,并且基因未发生突变。2.利用原核表达系统表达蛋白,将构建质粒转入BL21（DE3）感受态中,用IPTG低温诱导表达,SDS-PAGE分析诱导前后菌液和镍柱纯化的融合蛋白,分析表明成功表达出了可溶性的H-AFV,H-diAFV,H-triAFV和H-tetAFV。其间优化表达条件确定四种蛋白最佳诱导表达条件为18℃,220 rpm,表达10 h。3.测试目的蛋白与小鼠IgG的结合活性,间接ELISA测定其结合活性,H-tetAFV与小鼠IgG结合性能更强,生物膜干涉仪（BLI）测定其亲和力,H-tetAFV与小鼠IgG的亲和力最强为42 nM,H-AFV、H-diAFV和H-triAFV与小鼠IgG的亲和力分别为:77.3 nM、59.2 nM和50.4 nM。根据数据显示随着纳米抗体价位的升高亲和力也随着增高,分析其主要原因是其结合常数随着纳米抗体价位的升高而减小。4.对定向偶联免疫亲和柱制备过程进行优化,当改变纳米抗体投入量时免疫亲和柱的静态吸附量也随着变化,对于H-diAFV和H-tetAFV蛋白制备的亲和柱,当投入量为6mg/mL时,静态吸附量达到最高值,一旦投入量超过这个值则静态吸附量随着下降,而H-AFV蛋白和H-triAFV蛋白的投入量分别超过8 mg mL-1和5 mg mL-1时出现静态吸附量下降的情况。5.探究了亲和柱的性能,H-AFV、H-diAFV、H-triAFV和H-tetAFV最大静态吸附量分别是,7.53±0.41 mg mL-1,13.8±0.59 mg mL-1,7.5±0.86 mg mL-1 和12.76±0.66 mg mL-1。从上述数据可以观察到,H-diAFV和H-tetAFV的静态吸附量提高了,分别提高了 83.3%和69.4%。然后随着价位的升高H-triAFV的静态吸附量没有得到提高,初步猜测是空间结构的影响了其与小鼠IgG的结合。针对H-diAFV和H-tetAFV制备的亲和柱测试使用次数的性能,重复使用10次后小鼠IgG的洗脱率依旧能到达75%以上。研究了不同浓度的NaOH（1N,0.5N,0.1N）洗涤免疫亲和柱对其静态吸附量的影响,发现H-triAFV制备的亲和柱能反而能耐受较高的碱性,在0.1N的NaOH的条件下静态吸附量依旧能达到原有的32.6%。