减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒治疗结直肠癌的体内外研究

作     者：魏晓东 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张灵

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：结直肠癌 减毒沙门氏菌 STAT3 PD-L1 RNAi 基因治疗 

摘      要：背景:结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,好发于直肠与乙状结肠交界处。外科手术和化学疗法长期以来是结直肠癌患者的首选,然而其治疗效果欠佳,特别是对于具有转移性病变的患者预后较差。在结直肠癌的治疗中,靶向治疗是一种新方法,成功延长了结直肠癌患者的总体生存期。随着抗表皮生长因子受体(EGFR)药物和抗血管生成(VEGF)药物的成功应用,阻断不同关键途径的新药物以空前的速度出现,其中针对PD-1/PD-L1的免疫疗法让更多肿瘤患者获益。在2017年,美国食品药品监督管理局(FDA)首先批准了PD-1抑制剂帕博利珠单抗(pembrolizumab,俗称K药)用于治疗带有微卫星高度不稳定(MSI-H)/错配修复缺陷(d MMR)的转移性结直肠癌患者。程序性死亡受体1(PD-1),是一种重要的免疫抑制分子,为免疫球蛋白超家族中的一员,在免疫细胞膜表面广泛存在,而PD-L1是其配体,在肿瘤细胞表面存在。PD-1和PD-L1结合可启动T细胞的程序性死亡,诱导肿瘤细胞免疫逃逸,因而,以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植等均有重要的意义。近年来,PD-1/PD-L1抗体药物越来越得到重视,目前已有6种抗PD-1/PD-L1抗体药物经美国FDA批准上市,并在多种类型肿瘤治疗上取得了显著疗效。但在治疗过程中也出现靶向性较差及多种不良反应,如免疫性心肌炎等并发症,死亡率高达46%,这为该类疗法的广泛使用提出了挑战。信号传导与转录激活因子3(STAT3)是信号传导与转录激活因子蛋白家族成员,以其在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭和免疫抑制中的作用而闻名,作为一种转录因子参与Cyclin D1、Bcl-2等蛋白的表达调控,是癌症治疗最有希望的靶点之一。有文献报道,STAT3可直接结合到PD-L1的启动子区,从而促进PD-L1的转录及表达,这提示STAT3可能通过PD-L1参与肿瘤细胞免疫逃逸;采用RNA干扰技术沉默STAT3能够抑制结直肠癌细胞的增殖,诱导凋亡,但RNA干扰技术的体内递送系统是目前的技术瓶颈。在课题组前期工作中,我们利用减毒沙门氏菌靶向载体携带sh STAT3质粒,已在前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、喉癌等移植瘤治疗过程中取得了良好的效果,有效改善了靶向性差等问题。因此,本研究旨在利用减毒沙门氏菌携带双干扰sh STAT3/sh PD-L1质粒精准靶向肿瘤组织,同时通过抗增殖、促凋亡和增强自身抗肿瘤免疫功能等多方面发挥抗癌功能,在结直肠癌靶向治疗方面具有良好的临床应用前景和实用价值。目的:探讨减毒沙门氏菌携带共表达sh STAT3和sh PD-L1质粒的抗结直肠癌效应。方法:(1)运用基因重组技术构建共表达sh STAT3和sh PD-L1质粒;以真核细胞转染技术转染鼠结肠癌CT26细胞株。(2)应用电转化技术将sh STAT3/sh PD-L1重组质粒转化入减毒沙门氏菌pho P/pho Q突变株。(3)FITC-Annexin V/PI流式细胞术及Western blot检测重组质粒对CT26细胞周期、凋亡的影响。(4)CCK-8实验及克隆形成实验检测sh STAT3/sh PD-L1重组质粒对鼠结肠癌CT26细胞株细胞活力和增殖能力的作用。(5)Transwell小室侵袭实验及细胞划痕实验检测重组质粒对CT26细胞迁移能力的影响。(6)减毒沙门氏菌携带sh STAT3/sh PD-L1重组质粒对皮下荷瘤模型C57BL/6N小鼠的治疗:腹腔注射治疗,对肿瘤体积及小鼠体重进行统计分析;对小鼠肿瘤组织及其各脏器组织切片进行H&E染色,检测肿瘤组织及主要脏器细胞形态;对小鼠肿瘤组织进行Western blot实验及免疫组织化学染色,检测凋亡、周期相关蛋白的表达;ELISA实验检测小鼠血清细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α浓度变化。(7)减毒沙门氏菌携带sh STAT3/sh PD-L1重组质粒对原位结直肠癌模型C57BL/6N小鼠的治疗:腹腔注射治疗,对小鼠体重、肿瘤数量等进行统计分析,观察治疗效果及小鼠脾脏免疫细胞变化。结果:(1)成功构建sh STAT3/sh PD-L1重组质粒;sh STAT3/sh PD-L1重组质粒成功导入减毒沙门氏菌pho P/pho Q突变株。(2)流式细胞术及Western blot结果显示,重组质粒使CT26细胞发生G1期阻滞(P0.001),G1期阻滞相关蛋白Cyclin D1表达显著下调(P0.01);重组质粒使CT26细胞凋亡细胞比例显著增加(P0.001),Cleaved Caspase-3蛋白显著增加(P0.001),Bcl-2表达水平显著降低(P0.001),Bcl-2与Bax蛋白比值下降(P0.01),提示重组质粒通过促凋亡及周期阻滞进而抑制细胞