梓醇通过抑制内质网应激和NOX4表达改善棕榈酸诱导的HepG2细胞脂质蓄积及胆固醇代谢平衡紊乱
作者单位:大连医科大学
学位级别:硕士
导师姓名:孙慧君
授予年度:2017年
学科分类:1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要:背景:非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以脂质代谢异常为主要特征的代谢性疾病。在非酒精性脂肪性肝病中,肝脏胆固醇平衡紊乱会导致肝脏胆固醇蓄积。近年来研究表明,内质网应激和氧化应激与非酒精性脂肪性肝病的发病密切相关。因此,减少肝脏脂质蓄积、胆固醇平衡紊乱、内质网应激以及氧化应激对改善非酒精性脂肪性肝病具有重要意义。梓醇(Catalpol)是从地黄块根中提取的一种环烯醚萜类的天然产物,它具有抗氧化、调节脂质代谢的作用。但是梓醇对非酒精性脂肪性肝病的作用及机制未见报道。目的:通过建立棕榈酸(Palmitic acid,PA)损伤的人肝癌细胞(HepG2 cells)体外模型研究梓醇对非酒精性脂肪性肝病的脂质蓄积和胆固醇代谢紊乱的抑制作用及相关分子机制。方法:1、梓醇对PA诱导的HepG2细胞脂质蓄积、胆固醇平衡紊乱、内质网应激以及氧化应激作用的研究HepG2细胞随机分为6组:(A)正常对照组;(B)梓醇正常给药组(25μM);(C)PA损伤组(300μM);(D)PA+低剂量梓醇组(12.5μM);(E)PA+中剂量梓醇组(25μM);(F)PA+高剂量梓醇组(50μM)。梓醇和PA共同作用于HepG2细胞24 h后,取细胞或细胞培养基进行下一步实验。用相应试剂盒检测HepG2细胞总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和培养基乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)水平。油红O染色评价细胞脂质蓄积水平,Western blot方法检测HepG2细胞胆固醇平衡相关指标SCAP、SREBP-2、LDLr、HMGCo A-r、CYP7A1、ABCA1,NOX4及p22phox,内质网应激相关指标GRP78、ATF4、ATF6、CHOP、PERK、p-PERK、IRE1α、p-IRE1α、e IF2α、p-e IF2α,NF-κB通路相关指标p65、p-p65和凋亡相关指标Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9进行检测。Real-time PCR方法检测HepG2细胞SCAP、SREBP-2、LDLr、HMGCo A-r、CYP7A1、ABCA1、GRP78、ATF4、CHOP的m RNA表达。2、梓醇抑制PA诱导的HepG2细胞脂质蓄积与胆固醇平衡紊乱机制研究(1)HepG2细胞随机分为4组:(A)正常对照组;(B)PA损伤组(300μM);(C)PA+TUDCA组(2.5 m M);(D)PA+DPI组(10μM),Western blot方法检测HepG2细胞LDLr、HMGCo A-r、CYP7A1、ABCA1蛋白表达水平,油红O染色评价HepG2细胞脂质蓄积水平。(2)HepG2细胞随机分为3组:(A)正常对照组;(B)PA损伤组(300μM);(C)PA+TUDCA组(2.5 m M),Western blot方法检测HepG2细胞NOX4蛋白表达水平。(3)HepG2细胞随机分为3组:(A)正常对照组;(B)PA损伤组(300μM);(C)PA+DPI组(10μM),Western blot方法检测HepG2细胞GRP78蛋白表达水平。结果:通过油红O染色结果显示,梓醇显著减少PA诱导的HepG2细胞的脂质蓄积。同时,梓醇显著降低PA诱导HepG2细胞的TG、TC、FFA、MDA、LDH水平并增加GSH、SOD水平。而且,梓醇显著增加PA诱导的HepG2细胞的SCAP、SREBP-2、LDLr、HMGCo A-r、CYP7A1并显著降低ABCA1的蛋白及m RNA表达水平。梓醇还能够降低PA诱导的HepG2细胞的内质网应激相关指标及NOX4和p22phox的表达。给予ER stress抑制剂TUDCA作用后,PA诱导的HepG2细胞NOX4的蛋白表达显著下降;给予NOX抑制剂DPI作用后,PA诱导的HepG2细胞GRP78的蛋白表达也显著下降。当给予TUDCA或DPI时,PA诱导的HepG2细胞的脂质蓄积减少,LDLr、HMGCo A-r、CYP7A1蛋白表达量升高且ABCA1的蛋白表达显著降低。另外,梓醇显著降低NF-κB通路相关指标p-p65、核内p65的蛋白表达水平以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3的蛋白表达水平。结论:1.梓醇能够改善PA诱导的HepG2细胞脂质蓄积、胆固醇平衡紊乱、内质网应激和NOX4过表达。2.梓醇