锌失衡对肝脏的氧化损伤及漆黄素的保护效应研究

作     者：王中杭 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯杰

授予年度：2022年

学科分类：090502[农学-动物营养与饲料科学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：锌 仔猪 肝脏 氧化应激 细胞凋亡 自噬 漆黄素 

摘      要：锌作为动物机体必需的微量元素之一,在机体生长发育过程中发挥重要作用。缺锌会造成免疫力降低,生殖系统受损,生长性能下降等负面影响,日粮中添加高锌可改善机体抗氧化性能,促进生长发育,生产中常使用高锌日粮提高养殖效益。然而长时间高锌暴露会对机体造成损伤,肝脏作为机体中最大的腺体,具有代谢蛋白质、脂肪、碳水化合物和分泌胆汁等多种功能,其含有的大量线粒体是产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）主要场所,故肝脏在机体受损时易受ROS攻击引发氧化损伤。植物多酚具有的酚羟基结构能够清除自由基,是天然的抗氧化剂。漆黄素（3,3’,4’,7-四羟基黄酮,Fisetin）作为一种生物活性黄酮醇分子,具有良好的抗氧化活性。本试验选取仔猪及小鼠为研究对象,从氧化应激、细胞凋亡及自噬等方面探究缺锌及锌过量日粮对肝脏的影响,并建立AML12细胞锌失衡模型,深入研究锌失衡对肝细胞造成的氧化损伤及对细胞凋亡与自噬的影响,进一步选取漆黄素为研究对象,探究漆黄素对锌失衡诱导的肝脏损伤的保护作用及其相关机制。主要研究结果如下:1.不同锌水平日粮对仔猪肝脏的影响本试验选取120头38日龄的杜长大仔猪为研究对象,分别饲喂不额外添加任何锌源的基础日粮（低锌组）,添加100 mg/kg ZnSO4（以锌元素计）的正常锌水平日粮（正常锌组）,以及添加2250 mg/kg氧化锌（以锌元素计）的高锌日粮（高锌组）。预试验3天,正式试验35天,试验结束后取肝脏组织测定相关指标,试验结果如下:（1）低锌组T-AOC、T-SOD活力及CAT活力与正常锌组相比差异不显著;高锌组T-AOC极显著升高（P0.05）,T-SOD活力及CAT活力具有升高趋势。（2）与正常锌组相比,低锌组仔猪肝脏LDH活性显著升高（P0.05）,高剂量氧化锌组LDH活性具有升高趋势。（3）与正常锌组相比,低锌组促凋亡蛋白Bax表达水平显著升高（P0.05）,高锌组其蛋白表达水平具有升高趋势。（4）低锌组自噬相关蛋白Beclin-1表达水平具有升高趋势,而高锌组蛋白表达被抑制。以上结果表明,高锌长时间作用能够提高仔猪肝脏T-AOC,但也会对机体造成损伤;饲喂低锌或高锌日粮均会引起肝细胞凋亡,饲喂低锌日粮可诱导肝脏细胞自噬,而长时间高锌暴露抑制自噬。2.不同锌水平日粮对小鼠肝脏的损伤作用试验选取3周龄的雄性C57BL/6小鼠48只,分别饲喂不额外添加锌源的基础日粮（基础日粮锌含量为17 mg/kg）（缺锌组）,添加30 mg/kg ZnCO3（以锌元素计）的正常饲粮（正常锌组）,及添加150 mg/kg ZnCO3（以锌元素计）的高锌日粮（高锌组）,进一步验证锌失衡对肝脏的损伤作用,预饲养3天,正式试验天数为28天,试验结果如下:（1）与正常锌组相比,饲喂缺锌日粮或高锌日粮可极显著提高小鼠肝脏LDH活性（P0.01）。（2）与正常锌组相比,缺锌组小鼠肝脏ROS水平极显著升高（P0.01）,小鼠肝脏T-SOD活力及T-AOC显著降低（P0.05）,GSH含量下降,MDA含量显著升高（P0.05）;高锌组ROS水平及MDA含量显著升高（P0.05）,T-SOD、GSH、T-AOC具有下降趋势。此外,高锌组内质网应激相关蛋白CHOP表达显著提高（P0.05）,缺锌组具有上升趋势。（3）与正常锌组相比,缺锌组及高锌组抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达受到显著抑制（P0.05）,而Bax表达水平显著提高（P0.05）。（4）缺锌组LC3Ⅱ/Ⅰ下降,高锌组LC3Ⅱ/Ⅰ升高,p62的蛋白表达与之呈现相反的趋势。以上结果表明:锌失衡日粮会引起小鼠发生内质网应激,抗氧化性能下降;缺锌或高锌日粮均会诱导小鼠肝细胞凋亡增加;高锌饲养促进小鼠肝细胞自噬,缺锌饲喂抑制自噬。3.锌失衡对小鼠肝细胞的损伤效应本试验以小鼠肝细胞AML12为研究对象,通过50 μM TPEN（锌离子特异螯合剂）或250μMZnSO4处理建立体外锌失衡模型,进一步探究其对肝脏细胞的损伤作用及其机制。结果如下:（1）AML12 细胞经不同浓度 ZnSO4（150 μM、200 μM、250 μM、300 μM、350 μM）处理2、4、6 h后结果显示,在相同处理时间条件下,细胞活力随着ZnSO4浓度的升高呈下降趋势,相同浓度的ZnSO4处理细胞时,细胞活性随着处理时间的延长而下降。250 μMZnSO4处理细胞4h后细胞活性接近50%。以4h为处理时间,50 μM TPEN处理后细胞活性接近50%。试验选取250 μM ZnSO4（高锌组）和50 μM TPEN（缺锌组）处理建立锌失衡模型。（2）锌失衡可显著提高培养液中LDH活力（P0.05）。（3）锌失衡处理组细胞ROS的生成极显著增加（P0.01）,MDA水平呈升高趋势,T-AOC、GSH水平极显著降低（P0.01）。（4）与对照组相比,锌失衡模型组细胞Annexin V-EGFP绿色荧光信号及PI红色荧光均增强,Bax蛋白表达显著增加（P0.05）。（5）与对照组相比,缺锌组LC3Ⅱ/Ⅰ显著下降（P0.05）,p62蛋白表达具有升高趋势,高锌组LC3Ⅱ/Ⅰ极显著升高（P0.01）,p62蛋白表达较对照组显著下降（P0.05）。以上结果提示,锌失衡可降低AML12细胞活力,造成细胞氧化损伤,诱导细胞凋亡,缺锌抑制细胞自噬,而高锌处理促进细胞自噬。4.漆黄素对锌失衡造成的肝细胞氧化损伤的保护作用上述研究表明锌失衡引起的氧化应激是导致机体损伤的主要原因。本试验旨在探究漆黄素对锌失衡引起的肝脏损伤的保护作用及其相关机制。结果如下:（1）20μM、40μM、60 μM的漆黄素与250 μM ZnSO4共同处理细胞均可显著提高细胞活力,后两组之间细胞活力差异不显著,因此,选取浓度为40 μM的漆黄素进行后续研究。40 μM漆黄素+50μMTPEN与漆黄素单独处理组之间细胞活力差异不显著。（2）漆黄素极显著抑制了锌过载导致的胞内ROS水平的升高（P0.01）,漆黄素+ZnSO4较ZnSO4组具有提高T-AOC、降低MDA的趋势,同时ZnSO4处理组细胞GSH含量较对照组极显著降低,漆黄素与ZnSO4共同作用可极显著提高细胞GSH含量（P0.01）。与ZnSO4单独处理组相比,漆黄素+ZnSO4可进一步极显著提高p-Nrf2的表达,HO-1表达具有上升趋势。（3）漆黄素组与对照组间胞内Zn2+浓度差异不显著,ZnSO4组与漆黄素+ZnSO4组胞内Zn2+含量之间差异不显著。以上结果表明,漆黄素可呈剂量依赖性提高细胞活力,缓解高锌诱导的氧化损伤,其保护能力与调控Nrf2/HO-1信号通路有关。综上所述,体内外试验表明低锌或高锌处理均会造成仔猪及小鼠肝脏损伤,引起细胞凋亡,细胞试验进一步显示,缺锌抑制细胞自噬,而高锌处理促进细胞自噬。漆黄素对缓解高锌诱导氧化损伤具有良好的保护作用,其保护能力与调控Nrf2/HO-1信号通路有关。