调控杜仲REF基因转录因子的筛选及分析

作     者：张传明 

作者单位：贵州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕立堂;周凤娇

授予年度：2021年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：杜仲胶 REF 转录因子 酵母单杂交 启动子 

摘      要：杜仲作为重要的国家战略资源树种,具有独特的药用价值和经济价值,杜仲胶作为杜仲特有的反式橡胶以其独特的理化性质在橡胶工业中占据重要地位。目前关于杜仲胶的研究多数局限在杜仲胶的合成应用,有关杜仲胶的合成积累机制及相应的胶合成基因研究较少,如橡胶延伸因子(REF)在三叶橡胶合成延伸中起重要作用,但其在杜仲中的功能作用却鲜有报道。本研究通过克隆REF基因启动子的序列,分析REF基因启动子中可能存在的顺式作用元件,并通过酵母单杂交筛选杜仲中与REF基因启动子区域互作的转录因子,分析转录因子的功能,揭示REF基因表达的调控模式,对于后续研究REF基因的作用机制具有重要意义。1.REF基因启动子序列的克隆分析根据杜仲基因组数据,通过PCR扩增克隆REF2(1999bp)、REF3(1957bp)和REF4(1974bp)基因的启动子序列,与基因组比对相似率分别为99.95%、90.89%、99.85%。通过Plantcare和Soft Berry分析REF2、REF3和REF4基因的启动子序列,发现植物激素和环境胁迫可能会对REF基因的表达起调控作用。2.杜仲REF基因的表达模式分析杜仲不同组织部位的REF基因表达量具有显著差异,通过外源激素处理后杜仲叶片REF基因表达量发生明显变化。将REF基因启动子GFP载体遗传转化烟草并通过激光共聚焦显微镜观察,发现除转REF4基因烟草叶片中GFP蛋白荧光信号较强外,其余烟草根茎叶中仅能检测到微弱的GFP蛋白荧光信号,表明杜仲REF4基因启动子可能具有叶片组织特异性。3.构建杜仲酵母单杂交文库及筛选REF基因启动子互作转录因子提取杜仲不同发育时期的根、茎、叶、果实等组织的总RNA,构建杜仲酵母单杂交筛选文库,凝胶电泳检测文库质量合格后用于后续酵母单杂交筛选试验。构建REF基因启动子诱饵载体,将其和杜仲文库质粒先后转入Y187酵母菌株,通过缺陷型培养基(添加抑制剂)培养,累计获得36个阳性克隆酵母菌落,提取质粒扩增后,委托公司代为测序,并通过NCBI进行比对分析发现13条DNA序列具有相应的蛋白功能。