MiR-30a-5p对PD小鼠模型GLT-1表达的调控效应及机制研究

作     者：孟行军 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：瞿少刚

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：帕金森病 谷氨酸转运体 谷氨酸兴奋性毒性作用 GLT-1 MiR-30a-5p 

摘      要：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大中老年常见的神经退行性疾病,其主要病理特征为中脑黑质多巴胺(Dopamine,DA)能神经元内形成以α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)为主要成分的路易小体(Lewy body,LB),进而导致多巴胺能神经元凋亡变性坏死。从而出现运动缓慢,静止震颤,肢体僵硬,姿态不稳等临床症状。PD的发病机制多种多样,包括年龄因素、环境因素、遗传因素、神经炎症、谷氨酸兴奋性毒性作用等。其中,谷氨酸兴奋性毒性在PD发病机制中的作用是国内外研究的一个热点之一。谷氨酸兴奋性毒性主要是由谷氨酸转运体(Glutamate transporter)的表达以及功能异常引起,谷氨酸转运体表达以及功能异常均可导致星形胶质细胞以及神经元摄取突触间隙谷氨酸减少,特别是表达在星形胶质细胞上的谷氨酸转运体-1(Glutamate transporter-1,GLT-1,也被称为EAAT2))的表达和功能异常,从而导致DA能神经元损伤。因而可以通过提高和改善星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1的表达以及功能使细胞外谷氨酸浓度维持在正常生理水平,避免DA能神经元遭受高浓度谷氨酸的兴奋性毒性效应。因此,研究针对谷氨酸转运体的调控机制具有重要的意义。近几年来,MicroRNA(miRNA)成为了一个研究的热点,大量研究发现miRNA与神经退行性疾病的发生、发展相关,也有与PD发生发展相关的miRNA的报道,比如miR-133b,miR-7,miR-7116-5p,miR-124,miR-126,miR-155 等,并且有部分miRNA的靶基因已经得到了确证。但到目前为止,除了本实验室的研究之外还未见到针对谷氨酸转运体的miRNAs在PD发生发展中作用的报道。基于谷氨酸转运体在谷氨酸兴奋性毒性和PD发生、发展中的重要作用,那么PD发病中调控谷氨酸转运体GLT-1的miRNA有哪些?其调控效应及机制是什么?对PD发病具有什么意义?调节针对谷氨酸转运体GLT-1的miRNA能否达到缓解或治疗PD的目的?能否成为治疗PD的新靶标?解决这些问题,对PD的防治具有十分重要的临床意义。本研究主要鉴定PD发病中针对谷氨酸转运体GLT-1发挥调控作用的miRNA,阐明其调控机制及在PD发病中的意义,通过干预特定miRNA来提高GLT-1的表达与功能,从而降低谷氨酸的神经毒性效应,缓解PD病情,为临床治疗PD提供新靶标、新途径。我们在前期实验室高通量测序以及生物信息学分析的实验基础上选择miR-30a-5p进行后续研究。在前期实验中,我们课题组利用神经毒素MPTP制备PD小鼠模型,在造模后选择不同时间点分别检测大脑不同区域(大脑皮层、中脑黑质、海马、小脑)miRNAs的表达谱,与正常对照组进行比较,筛选出差异表达的miRNAs,并对差异表达的miRNAs进行生物信息学分析,分析显示GLT-1基因Slc1a2是差异表达的miR-30a-5p的靶基因。我们首先通过细胞实验来研究抑制或过表达miR-30a-5p对GLT-1表达和功能的影响,结果显示在MPP+染毒的星形胶质细胞中抑制miR-30a-5p后GLT-1总蛋白和膜蛋白的表达水平显著增加,GLT-1的转运功能显著改善以及mRNA表达水平显著增加;过表达miR-30a-5p后GLT-1的mRNA表达水平明显降低,总蛋白和膜蛋白的表达水平明显降低,GLT-1的转运功能也明显降低。以上结果表明miR-30a-5p对GLT-1表达和功能都有影响。我们进一步在动物实验中验证了 miR-30a-5p对谷氨酸转运体GLT-1的调控作用。我们首先构建了包含miR-30a-5p抑制序列的绿色荧光蛋白标记的慢病毒,利用大脑立体定位仪将慢病毒定位注射入小鼠的一侧中脑黑质中。Western blotting和qPCR检测的结果显示,与PD组相比注射了慢病毒PD组小鼠中脑组织GLT-1的总蛋白水平、膜蛋白水平及mRNA水平都显著增加,突触体活性明显升高,中脑黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞明显增多,α-Syn明显减少,凋亡细胞亦明显减少。以上实验证实了 miR-30a-5p在PD小鼠模型中对谷氨酸转运体GLT-1具有重要的调控作用。我们的前期实验结果表明,不管是在体内还是体外miR-30a-5p对谷氨酸转运体GLT-1都具有重要的调控作用。因此,下一步我们使用双荧光素酶报告基因实验验证Slc1a2(GLT-1的基因名)是否是miR-30a-5p的靶基因。但遗憾的是,我们得到了阴性的结果,miR-30a-5p与Slc1a2之间没有直接作用,说明Slc1a2不是miR-30a-5p的靶基因,miR-30a-5p可能通过间接通路对GLT-1发挥调控作用。因此,我们对miR-30a-5p调节GLT-1的可能间接通路也进行了研究,首先我们对参与miR-30a-5p调控作用的信号通路进行了分析。我们发现,PD小鼠中PI3K、PKCα、STAT3分子明显的升高,mTOR分子明显的抑制,而在使用miR-30a-5p的抑制序列慢病毒以后可以显著降低PI3K、PKCα、STAT3通路蛋白以及显著升高mTOR通路蛋白,说明miR-30a-5p调节GLT-1表达和活性可能是通过PI3K、PKCα、STAT3、mTOR中一条或者几条通路共同发挥效应的,其确切通路机制有待后续进一步的研究。同时,我们使用免疫荧光双染技术检测了miR-30a-5p是否影响GLT-1的降解通路,我们发现miR-30a-5p的抑制序列慢病毒可以显著降低PD小鼠GLT-1降解的泛素-蛋白酶体途径,而不影响GLT-1的内吞-溶酶体降解途径,说明miR-30a-5p可以通过泛素-蛋白酶体降解途径导致GLT-1降解。基于以上的实验结果,我们使用PI3K(LY294002)、PKCα(Staurosporin)、STAT3(SH-4-54)抑制剂或mTOR(MHY1485)激动剂来处理原代星形胶质细胞,检测谷氨酸转运体GLT-1的表达以及功能的改变。我们发现LY294002以及SH-4-54并不改善由MPP+引起的GLT-1表达以及功能的变化。MHY1485能够明显地改善由MPP+引起的GLT-1功能的变化,而不改变GLT-1的表达。Staurosporin既可以明显提高GLT-1的表达,也可以明显改善由MPP+引起的GLT-1功能异常。由于前期,我们发现miR-30a-5p的抑制序列慢病毒可以显著降低PD小鼠GLT-1降解的泛素-蛋白酶体途径,我们使用以上通路抑制剂或激动剂来处理原代星形胶质细胞观察miR-30a-5p调控GLT-1泛素-蛋白酶体降解途径是否是通过这些分子。结果表明,staurosporin可以改善MPP+所引起的泛素-蛋白酶体降解途径的异常。基于这些结果,我们推测,miR-30a-5p可以在一定程度上通过PKCα信号通路来调节GLT-1的泛素化降解途径。最后,我们验证了 miR-30a-5p作为治疗PD靶标的可能性。我们发现使用miR-30a-5p shRNA处理的PD小鼠爬竿实验明显较PD组小鼠降低,悬挂实验明显较PD组小鼠增加,由此可以看出,miR-30a-5p shRNA可以明显的改善PD小鼠的行为学障碍。同时,我们检测了致病蛋白α-Syn以及多巴胺能神经元的改变,我们发现,较PD组小鼠,使用miR-30a-5p shRNA处理的PD小鼠中脑黑质中α-Syn明显减少,同时伴有纹状体以及中脑黑质部位多巴胺能神经元数目的增加。大量的研究表明,星形胶质细胞激活以及小胶质细胞激活在PD发生发展中发挥着重要作用,于是我们检测了 miR-30a-5p shRNA对星形胶质细胞以及小胶质细胞激活的影响,我们发现miR-30a-5p shRNA可以明显的抑制PD小鼠中脑黑质中星形胶质细胞以及小胶质细胞的激活。由此推断,miR-30a-5p shRNA可以通过抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活,从而改善PD小鼠的病理学变化。基于以上研究结果,我们认为,在PD发生发展中针对谷氨酸转运体GLT-1的miR-30a-5p发挥了一定的致病效应,其可以通过PKCα信号通路来调节GLT-1的泛素化降解途径,从而影响GLT-1的表达与功能,加重了谷氨酸的神经毒性效应,促进了 PD的病理进程。干预miR-30a-5p可以明显提高GLT-1的表达与功能,从而降低谷氨酸的神经毒性效应,缓解帕金森病病情,为临床治疗帕金森病提供新靶标、新途径。