甜樱桃bHLH家族转录因子发掘及抗寒功能鉴定

作     者：沈天娇 

作者单位：贵州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：乔光

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：甜樱桃 bHLH转录因子 全基因组分析 低温胁迫 表达分析 功能验证 

摘      要：碱性螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH,basic helix-loop-helix）是真核生物中最大的一类转录因子（TF,transcription factor）之一,它可以通过与靶基因中特定序列的相互作用来调节基因表达。bHLH转录因子不仅参与植物的生长代谢和发育过程,在植物应对非生物胁迫的反应中也起着重要作用。由于bHLH转录因子调节机制的复杂性,目前关于bHLH应答低温的调节机制研究仍然有限,相关报道仅限于拟南芥和其他模式植物。对于大多数非模式植物特别是木本果树bHLH成员的许多生物学功能还需要被深入研究。本研究基于甜樱桃（Prunus avium L.）全基因组数据库信息,对甜樱桃bHLH家族成员进行全面的基本生物学特征分析,发掘低温胁迫响应候选成员,并对其中PavbHLH28和PavbHLH61的功能进行了进一步的验证。主要内容及结果如下:1.从甜樱桃基因组数据库中共鉴定出66个非冗余的bHLH家族候选基因,除了6个成员没有被定位到任何一条染色体上外,其余的60个PavbHLH基因不均匀的分布于甜樱桃的8条染色体上。系统发育分析表明,甜樱桃PavbHLHs分为17个亚家族。基于PavbHLHs的氨基酸序列,我们鉴定到了10个Motif,Motif 1和Motif 2在几乎所有PavbHLH蛋白中高度保守。外显子-内含子分析表明,属于同一亚家族的PavbHLHs具有相似的基因结构。启动子分析发现大部分PavbHLHs启动子区域都包含低温响应元件以及其他非生物胁迫响应元件。此外,蛋白互作网络预测分析发现了几个PavbHLHs可能参与调控低温胁迫反应。2.通过RT-PCR技术对所有PavbHLHs在低温胁迫处理下的表达模式进行分析,结果表明,62个PavbHLH基因在不同的低温处理下均有不同程度的表达,其中约20个PavbHLHs在4℃和10℃处理的早期被快速诱导,达到峰值,随后表达下降,而在16℃处理下表达持续上调。结合qRT-PCR分析的结果,初步确定PavbHLH1,-18,-28,-60,-61,-65和-66可能参与冷胁迫反应调控。3.为了验证PavbHLH28和PavbHLH61的抗寒功能,首先对其进行了全长克隆,PavbHLH28序列全长1328 bp,编码435个氨基酸,蛋白分子量为46.52 kDa,等电点6.30。PavbHLH61序列全长756 bp,编码251个氨基酸,蛋白分子大小为28.18 kDa,等电点为7.05。分别对PavbHLH28和-61构建了GFP融合蛋白,通过瞬时转化技术分别导入拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,结果发现PavbHLH28和-61均定位于细胞核,与预测的结果一致。构建了含PavbHLH28和-61的植物超表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化,分别获得了超表达PavbHLH28的哥伦比亚拟南芥和超表达PavbHLH61的本氏烟草转基因植株。4.为了筛选与低温响应候选成员PavbHLH61具有相互作用的蛋白,我们构建了诱饵载体pGBKT7-PavbHLH61,首先对其进行自激活及毒性检测,结果发现PavbHLH61不具有自激活活性,对酵母也没有毒害作用。将诱饵载体与cDNA文库质粒共转化酵母菌株,经缺陷性培养基筛选、PCR阳性鉴定以及测序比对分析发现了21个非冗余的蛋白与PavbHLH61存在互作关系。其中PavbHLH162-like和Pav HIPP46-like蛋白可能与PavbHLH61相互作用并在冷应激反应中发挥重要作用。